徐栋梁，李洁颖，彭永鹤，夏立新*，刘志刚*

(1.深圳大学医学院过敏反应与免疫学研究所，广东深圳 518060；2.深圳市圣西马生物技术有限公司，广东深圳 518057)

抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)以其独特的优点显示出良好的应用与发展前景.抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子肽，广泛存在于各类动物、植物和微生物体内，是天然免疫系统的重要组成部分[1-2]，研究表明，抗菌肽不仅具有广谱抗各种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的活性，而且具有抗病毒、原生动物和肿瘤细胞等作用[3].

自1993年美国学者D.P.CLARK等首次从牛蛙皮肤内发现抗菌肽Ranalexin后[4]，国外学者对其做了深入研究，尤其是对革兰氏阳性菌和真菌有较好的抗菌活性[5]，抗菌肽天然资源有限，分离提取有一定困难，合成抗菌肽的成本高.基因工程表达成为大量生产的首选解决方案.

无脊椎动物体液中没有免疫球蛋白，缺乏抗体介导的特异性免疫系统，依赖先天性非特异性免疫系统识别和清除入侵的微生物维持机体健康.抗菌肽是蟹类的先天免疫因子之一，作为低御外源微生物入侵的第一道防线.研究蟹类动物非特异性免疫机理可作为蟹类养殖疾病防治提供理论依据和新的思路.目前，对拟穴青蟹的研究主要集中在线粒体COI基因序列的分析[6]、ISSR-PCR条件的优化[7]及DNA的优质提取方面[8]，还未发现关于拟穴青蟹抗菌肽蛋白的研究报道.本研究利用E.coliOrigamiTM(DE3)成功获得了含拟穴青蟹Crustin基因(简称CrusSp)的重组大肠杆菌菌株，转化E.coliOrigamiTM(DE3)中表达了CrusSp蛋白,研究了CrusSp蛋白的抗真菌和细菌的生物活性，为进一步探讨其抗菌感染机制奠定了基础.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试蟹和菌种 拟穴青蟹(ScyllaParamamosain)购于深圳南澳海鲜街.金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(CMCC 26003)、大肠埃希氏菌Escherichiacoli(CMCC 44825)、短小芽孢杆菌Brevibacillusbrevis(CICC 9003)、白色念珠菌Candidiasisalbicans(AS 2.2086)、黑曲霉Aspergillusniger(AS 3.3928)、白地霉Geotrichumcandidum(CICC 1315)、产黄青霉Penicilliumchrysogenum(AS 3.3890)和绿色木霉Trichodermaviride(AS 3.2942)购于广州市微生物研究所.

1.1.2 主要试剂 提取总RNA和RT-PCR试剂盒购自Qiagen公司,原核表达载体E.coliOrigamiTM(DE3)购自Invitrogen公司.pMD18-T载体、Ex-Taq酶、限制性内切酶BamHI及HindIII、T4 DNA连接酶和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自TaKaRa公司.Ni-NTA matrix 及柱子购自Amersham Pharmacia 公司.NA培养基与PDA培养基购于广州微生物研究所.

1.2 拟穴青蟹CrusSp编码基因的获得

从SWISS-PROT、TrEMBL、以及NCBI中搜寻蟹常见的Crustin基因，利用Clustal W程序对这些序列进行同源性比较，确定其保守区域并设计兼并引物(由上海生工生物技术服务有限公司合成)：

Crab5j 5’tcccgagtacctccatatctagg 3’ Crab3j 5’ ttagtagaattcaacagtcttgcatac3’

从拟穴青蟹血细胞中提取总RNA,进行RT-PCR, 通过5’-RACE和3’-RACE确定编码多肽的基因序列，克隆拟穴青蟹中抗菌肽的相似基因.将获得的拟穴青蟹抗菌肽编码基因片段连结于克隆质粒pMD18-T载体上，用氯化钙法将连接产物转化入E.coliTop10克隆菌中，通过含氨苄青霉素的LB平板进行抗氨苄筛选，挑取阳性菌落(含重组质粒)进行菌落PCR验证.挑取阳性菌落入LB培养基摇菌，提取质粒酶切电泳后送深圳华大基因科技有限公司测序鉴定.

1.3 序列分析

将测序所得序列通过GeneBank进行序列比对，推导其相应氨基酸序列，对该蛋白质的等电点和相对分子量利用在线程序Compute pI/Mw tool(http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html)进行评估.

1.4 重组表达载体的构建与鉴定

为了将拟穴青蟹CrusSpcDNA片段连入pET-32a(+)表达载体，在其cDNA片段的5’和3’末端通过PCR反应分别引入BamHI及HindIII酶切位点，PCR引物序列如下：

Crab5t 5’ggatcctcccgagtacctccata3’ Crab3t 5’aagcttttagtagaattcaacagtctt3’

回收PCR产物连接到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌Top10，菌落经PCR及BamHI和HindIII酶切鉴定.测序后，将带有目的基因的克隆质粒用BamHI及HindIII双酶切，然后按常规方法连结于经同样双酶切的表达质粒pET-32a(+)载体上，构建重组表达质粒.以重组表达质粒转化大肠杆菌Top10,菌落PCR鉴定，提取阳性质粒，进行双酶切鉴定，阳性克隆后经测序鉴定.

1.5 重组CrusSp蛋白的表达和纯化

挑取阳性菌落入LB培养基摇菌，提取质粒，行菌落PCR、酶切电泳及送深圳华大基因科技有限公司测序鉴定与原序列一致.

在条件为28 ℃、菌液OD600达到0.6时加入浓度为0.1 mmol/L的IPTG进行诱导，分别取诱导时间为0、2、4、6、8 h的菌体进行15% SDS-PAGE电泳，确定最佳诱导时间.超声破碎菌体后分别取上清和沉淀进行可溶性分析，Ni2+亲和层析柱纯化，10 mM Tris-HCI(pH 7.4)透析处理纯化的蛋白，15% SDS-PAGE 电泳，冷冻干燥后-80 ℃保存.

1.6 重组CrusSp蛋白的活力测定

将冷冻保存的蛋白用10 mM Tris-HCI(pH 7.4)溶解并BCA法定量，将培养至对数生长期的细菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、短小芽孢杆菌和白色念珠菌)(CFU=1.5×106个/mL)以1∶200比例均匀涂布于NA培养基琼脂平板上，待干燥后贴上无菌滤纸片(6.0 mm),将质量浓度为30 mg/mL和15 mg/mL的CrusSp蛋白溶液20 μL 加到无菌滤纸片上，以10 mM Tris-HCI(pH 7.4)为阴性对照，同时以含氨苄青霉素的药敏纸片为阳性对照，37 ℃孵育12 h后观察抑菌效果.

将白地霉、黑曲霉、绿色木霉和产黄青霉点种于PDA琼脂培养平板中央，待菌落生长到合适大小，将无菌滤纸片放到距离菌落边缘0.5 cm 处.将质量浓度分别为30、15 mg/mL的CrusSp蛋白溶液20 uL加到无菌滤纸片上，以10 mM Tris-HCI(pH 7.4)为阴性对照，同时以含氨苄青霉素的药敏纸片为阳性对照，28 ℃孵育72 h后观察抑菌效果.

2 结果

2.1 拟穴青蟹CrusSp基因的克隆

提取的拟穴青蟹总RNA通过RT-PCR扩增，扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳显示在273 bp左右有一亮带(图1).回收RT-PCR产物并与pMD18-T载体连接后转化E.coliTop10.挑取单菌落进行菌落PCR鉴定(图2)，阳性菌落进行测序.

图1 RT-PCR扩增结果Figure 1 RT-PCR amplification of CrusSp gene

M：DNA相对分子质量标准(DL2000);1：PCR得到的蟹CrusSp基因片段

图2 菌落PCR鉴定Figure 2 Colony PCR identification

1-3：拟穴青蟹CrusSpcDNA阳性克隆的菌落PCR鉴定;M:DNA相对分子质量标准(DL2000)

2.2 序列分析

克隆得到的CrusSp成熟肽基因由273个碱基组成(含终止密码子)，推导的核酸序列编码90个氨基酸(图3).经计算分析，推测该蛋白的分子质量为110.27 ku,等电点为8.54.

图3 拟穴青蟹CrusSp成熟肽核酸序列及推导的氨基酸序列Figure 3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the CrusSp

2.3 表达载体的构建及鉴定

提取阳性重组表达质粒并进行BamHI及HindIII双酶切和琼脂糖凝胶电泳分析(图4).插入的CrusSP片段的大小与预期一致.阳性克隆的DNA序列测定结果显示插入的片段准确无误.

2.4 拟穴青蟹CrusSp蛋白的诱导表达及纯化

将重组表达质粒转化入表达菌株E.coliOrigamiTM(DE3)进行诱导表达.28 ℃经0.1 mmol/L 的IPTG的诱导表达，分别取0、2、4、6、8 h的诱导菌行15% SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色显示在分子质量30.7 ku左右处有外源蛋白表达条带出现(空载体pET-32a表达的蛋白分子质量的理论值为20.4 ku)，蛋白分子质量与预期结果相符(图5).超声破碎菌体后分别取上清液和沉淀经15% SDS-PAGE进行可溶性分析，结果显示表达的重组蛋白主要分布在上清液中.将菌体裂解后的上清液采用Ni2+亲和层析柱进行了纯化，依次用6倍柱床体积的洗脱缓冲液(60、100、250、500 mmol/L 咪唑,0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9)进行洗脱,经15% SDS-PAGE检测(图6)为纯化蛋白，经冷冻干燥成粉末后- 80 ℃ 保存.

2.5 重组拟穴青蟹CrusSp蛋白的活力测定

采用滤纸片扩散法检测结果表明，重组拟穴青蟹CrusSp蛋白对绿色木霉有明显的抑菌活性(图7)，对白地霉、黑曲霉和产黄青霉没有抑菌活性(表1).

图4 重组表达质粒的BamH I/Hind III双酶切鉴定Figure 4 Enzyme digestion of the recombinant expression plasmids with BamH I and Hind III

1-4: 拟穴青蟹CrusSp 重组表达载体阳性克隆的菌落PCR鉴定;M：DNA分子质量标准(DL2000)

图5 拟穴青蟹CrusSp蛋白的诱导表达Figure 5 Expression of recombinant protein from Scylla paramamosain

Lane M: Protein standard makers;Lane 0: Expression of recombinant protein before induction;Lanes 2，4，6，8: Expression of recombinant protein after 2, 4, 6 and 8 hours

图6 拟穴青蟹CrusSp蛋白的可溶性分析及纯化Figure 6 The solubility analysis and purification of fusion protein

M:DNA相对分子质量标准(DL2000);1:未加IPTG诱导的菌体;2：诱导后菌体超声破碎上清液;3：菌体超声破碎后沉淀;4：穿透峰;5-8：(60 、100、250、500 mmol/L 咪唑);0.5 mol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.9洗脱蛋白

图7 拟穴青蟹CrusSp蛋白对绿色木霉的抑菌活性检测Figure 7 Effect of CrusSp on the growth of Trichoderma viride.

A: 20μL 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer as control;B: 20 μL 10 mg/mL Amp as positive control;C: 600 μg CrusSp in 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer;D: 300 μg CrusSp in 10 mM Tris-HCI(pH 7.4)buffer.

表1 拟穴表蟹CrusSp蛋白抑菌活性测定Table 1 Antimicrobial activity of CrusSp

3 讨论

抗生素的广泛使用导致越来越多的耐药菌出现，因此抗菌肽的研究具有巨大的开发潜力和应用价值.抗菌肽是由生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽，其生成和释放时机体炎症反应的组成部分，是宿主防御病原微生物入侵的重要分子屏障.抗菌肽具有分子量低、水溶性好、热稳定、强碱性和广谱抗菌等特点[9].继1975年瑞典科学家G.BOMAN等[10]人发现抗菌肽天蚕素以来，抗菌肽的研究已深入到分子结构、作用机制等多个方面.

由于抗菌肽具有分子质量小、在生物体内含量低、从生物体内分离困难等缺点，因此运用基因工程技术对抗菌肽进行重组表达成为大量生产的重要方式.本文通过搜寻蟹常见的Crustin基因，设计拟穴青蟹CrusSp基因的兼并性引物，从拟穴青蟹血淋巴细胞中提取总RNA,进行RT-PCR扩增编码CrusSp成熟肽的cDNA序列，将其克隆至pMD18-T载体进行扩增，然后克隆到pET-32a(+)表达载体中，转化至E.coliOrigamiTM(DE3)中表达CrusSp蛋白，通过Ni2+亲和层析柱纯化获得CrusSp蛋白，采用滤纸片扩散法检测对绿色木霉有抗菌活性，但对其它测试菌株没有表现出抑菌活性，可能是构建的原核表达质粒蛋白带尾片段影响Crustin的构象.研究清除在以后的试验中需要标签，以获得活性更大的Crustin蛋白.

本研究仅对从拟穴青蟹克隆的抗菌肽的体外抗菌活性进行了鉴定，关于其体内的活性还有待证实.随着人们对水产动物抗菌肽结构和功能的研究，通过对相关抗菌肽基因进行有目的的加工修饰，可以改造并合成稳定、高效、特异且对宿主细胞无害的抗菌肽基因，并通过基因工程菌进行表达，实现批量生产.尽管目前还有很多问题没有解决，但随着研究的逐步深入，水产动物抗菌肽将会对水产业的发展起到重要的作用.

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