张 涛河南省安阳市食品药品检验所，河南安阳 455000

LC-MS/MS法分析减肥保健食品中非法添加的酚酞

张 涛河南省安阳市食品药品检验所，河南安阳 455000

目的 建立减肥保健食品中非法添加化学成分酚酞的检测方法。 方法 采用LC-MS/MS联用技术，采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱，以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱，流速：0.2 mL/min；柱温为35℃，电喷雾电离,正离子模式，多重反应监测扫描方式对酚酞的母离子（m/z319）及其子离子（m/z197和225）进行检测。 结果 建立检测减肥保健食品中非法添加的酚酞的检测方法，检测限低于0.06 ng。在抽取的70批次市售减肥保健食品中，19批次检出了酚酞。 结论 该方法专属性强、灵敏度高,可用于减肥保健食品中非法添加的酚酞的筛选与确证工作。

高效液相色谱-质谱；检测；保健食品；非法添加；酚酞

酚酞是一种泻药，在小肠碱性肠液中通过刺激肠壁内神经丛，使肠蠕动增加产生缓泻作用，过量或长期滥用可使血糖升高,血钾降低，造成电解质紊乱,诱发心律失常、神志不清、肌痉挛以及倦怠无力等症状[1-2]。由于酚酞价格低廉，而且短时间有减肥效果，所以一些不法商家为牟取暴利，把酚酞非法添加到减肥保健食品中，对消费者造成危害。酚酞的分子式为C20H14O4，分子量为318.32，CAS号为77-09-8，其结构式见图1。

本研究采用液质联用技术、多重反应监测扫描方式，建立了酚酞的筛选鉴定方法，为更好地打击不法行为提供可靠的技术支撑。

图1 酚酞的结构式

1 材料与方法

1.1 仪器

美国 Agilent Technologies 公司配备电喷雾离子源（ESI）的 6410 型三重串联四级杆质谱仪（Mass Hunter Workstation Date Acquisition工作站），Agilent高效液相色谱系统（包括1200低压四元泵，自动进样器，柱温箱）；Waters高效液相色谱仪Alliance系统（包括2695低压四元泵，自动进样器，柱温箱，2996PDA二极管阵列检测器，EmpowerⅡ色谱工作站）；Mettler AE-240型电子天平。

1.2 试药

酚酞对照品来自中国药品生物制品检定所；样品从市场购买；乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他试剂为分析纯。

1.3 实验方法

1.3.1 HPLC条件 液相用色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；液质联用色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）；以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱见表1、2；液质联用流速为0.2 mL/min，液相为1 mL/min；柱温为35℃；进样量为10 μL；波长225 nm。

1.3.2 MS条件 ESI；正离子模式；多重反应监测（MRM）扫描方式；毛细管电压：4 kv；干燥气流速：8.0 L/min；干燥气温度：350 ℃；四级杆雾化器压力：30 psi；碰撞气压力：2 mtorr；检测器电压：1.5 kv；扫描间隔时间：0.1 s。

1.3.3 对照品溶液的配制 对照品储备溶液：取酚酞对照品约25 mg，精密称定，置于50 mL容量瓶中，甲醇适量，超声15 min使之溶解，放冷至室温，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。对照品溶液：分别精密量取对照品储备溶液1 mL置于100、25、10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀；再精密量取对照品储备溶液10 mL置于25 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得每 1 毫升中各含成分 0.005、0.020、0.050、0.200、0.500 mg的系列标准溶液，作为标准曲线对照品溶液。

表1 液相洗脱程序

表2 液质联用洗脱程序

1.3.4 样品溶液的配制 取样品适量（茶剂取1袋；胶囊剂取1次服用量，带囊壳），置50 mL量瓶中，加甲醇30 mL，超声15 min使溶解，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

1.3.5 对照品与样品测定 取对照品溶液与样品溶液经0.22 μm微孔滤膜滤过后，分别取10 μL注入液相色谱仪进行初筛和初步定量，结果见图2、3。根据初筛结果，稀释对照和样品溶液约为50 ng/mL，分别取10 μL注入液质联用仪，按照LC-MS/MS测定条件进行分析，结果见图4、5。

2 结果

2.1 质谱条件的优化

取上述对照品溶液，选用电喷雾离子源正离子化模式，直接进样，进行质谱条件的优化。首先，运行MS2 scan (一级全扫描方式)，可得到准分子离子峰[M+H]+为319；然后再运行MS2 sim (选择性离子监测)优化Fragmenator（碰撞诱导解离电压），得到最佳的Fragmenator；最后进行Product Ion（子离子扫描），选择子离子及其最佳Collision Energy（碰撞能量）,选择丰度最大的子离子为检测离子，使MRM具有较高的灵敏度。在样品测定中适当增加离子对进行筛选,使其具有更高的专属性，可有效防止出现假阳性，结果见表3。

2.2 检测限

取对照品溶液适量，加流动相稀释，按上述液质联用条件进行测定，以S/n=3，计算检测限（LOD）为0.06 ng。

2.3 样品测定结果

进行样品测定时，如样品液相色谱图中检出与酚酞对照品保留时间一致的成分，应进行质谱MRM确证，如果样品的保留时间和特征离子及其产生的子离子均与对照品相同，则判断该样品中含有酚酞。在抽取检验的70批次样品中，检出有19批次添加了酚酞，检出率达27%。

图4 酚酞对照品的MS/MS图

表3 酚酞的质谱条件优化结果

图5 样品中酚酞成分的验证MS/MS图

3 讨论

3.1 液相初筛

由于样品有茶剂、胶囊剂，且内含量无法准确估量，为避免样品浓度太大污染液质联用仪，所以先进行液相初筛和初步定量，根据液相结果再调整浓度进行液质联用确证。

3.2 流动相的选择

根据参考文献，采用C18柱，主要在以下几种流动相的基础上进行探索性试验：流动相Ⅰ：0.5%甲酸-乙腈（70∶30）[3]；流动相Ⅱ：0.1%甲酸和甲醇不同比例[4]；流动相Ⅲ：0.02 mol/L醋酸铵-0.1%醋酸水溶液/乙腈不同比例。

样品有胶囊剂、茶剂，样品成分复杂，为使酚酞和其他干扰成分有效分离，分别变换其中各成分比例、酸含量及酸种类进行试验。结果表明，以含0.1%冰醋酸的20 mmol/L醋酸铵溶液为流动相A，以甲醇为流动相B，梯度洗脱条件下，酚酞与样品中其它成分分离较好，故选择此流动相。

3.3 应注意的问题

对照品与样品浓度不要太高，否则残留严重，需要较长时间的冲洗；所用样品、玻璃仪器与试剂等要防止交叉污染，避免造成假阳性结果的出现[5]。

[1] 马微，王海波，王强，等.减肥保健食品中非法添加酚酞和西布曲明的同时检测 [J].食品科学，2010，31（4）：156-160.

[2] 曾涛.常用减肥药物的不良反应[J].中国药事，2007，10（6）：599-601.

[3] 胡青，崔益泠，王柯，等.减肥类保健食品中非法添加酚酞定性定量检测方法的研究 [J].中国药学杂志，2007，42（8）：624-625.

[4] 李丹，文红梅，崔福春，等. LC-MS/MS法快速筛选保健食品中非法添加的11种减肥化学成分[J].中国药事，2009，23（4）：335-338.

[5] 吴卫涛，李亮.减肥保健食品中非法添加盐酸西布曲明的检测[J].中国药事，2010，19（18）：34-35.

Analysis of phenolphthalein illegally added into functional food by LC-MS/MS

ZHANG Tao
Anyang Institute for Food and Drug Control，Anyang 455000,China

ObjectiveTo develop a LC-MS/MS method for the identification of illegal addition of chemical substance Phenolphthalein in health food.MethodsLC-MS/MS method was adopted. The separation was achieved by using Zorbax Eclipse Plus C18column with gradient eluent composed of 2 mmol/L ammonium acetate containing 0.1% acetic solution-methanol. The flow rate was 0.2 mL/min and the column temperature was set at 35℃.The target compound was analyzed with mass spectrum in the Multiple- reaction monitoring mode via positive ion mode.ResultsThe illegal addition of chemical substance Phenolphthalein in health food was detected on the basis of mass spectra. The LOD was below 0.06 ng. Among the 70 samples,19 samples contained Phenolphthalein.ConclusionThe method is sufficiently selective and sensitive to detect the Phenolphth alein in health food.

LC-MS/MS;Detection;Health food;Illegal addition;Phenolphthalein

R917

A

2095-0616（2011）18-98-03

2011-07-15）