唐孝鹏，苏 敏，张玉良，肖 敏

(嘉吉烯王生物工程(武汉)有限公司，湖北武汉 420223)

油脂中花生四烯酸含量测定

唐孝鹏，苏 敏，张玉良，肖 敏

(嘉吉烯王生物工程(武汉)有限公司，湖北武汉 420223)

建立了一种对油脂中花生四烯酸含量的检测方法，在加入内标的基础上，使用氢氧化钾－甲醇溶液甲酯化，生成的脂肪酸甲酯使用DB－23毛细管柱进行分离检测，结果采用内标法进行分析。结果表明:该方法的回收率在99.58%，仪器精密度RSD为0.45%，方法精密度RSD 0.85%，方法重现性RSD 0.74%。本方法能准确、有效地对油脂中的花生四烯酸含量进行检测，能满足实际检测工作的需要。

内标法，花生四烯酸，气相色谱法

花生四烯酸属n－6系列长链多不饱和脂肪酸，研究表明，ARA在血液、肝脏、肌肉和其他器官系统中作为与磷脂结合的结构脂类起着重要的作用。作为人体必需脂肪酸，是细胞膜的组成成份，是大脑和神经系统、免疫系统、心血管系统及皮肤必不可少的物质［1］。它具有其他物质所不具备的生命体必需的生物活性，特别对婴幼儿智力发育和视网膜都有极好的作用［2］。另外的研究表明，ARA还具有很多重要的保健功能，如益智健脑、提高视敏度、酯化胆固醇、增加血管弹性、降低血液黏度、调节血细胞功能、调节血脂和血糖、抗炎症等作用［3］。油脂中脂肪酸含量的检测方法主要是气相色谱法。脂肪酸的极性较强，因此需要将脂肪酸衍生成脂肪酸甲酯进行分析，以得到更为可靠和重复性的数据。常用的方法有三氟化硼法、三甲基氢氧化硫法、酯交换法等［4－6］，本文使用氢氧化钾甲醇法对油脂进行甲酯化处理，并使用内标法进行检测研究，计算花生四烯酸的含量，此法具有操作简便、快速，重现性好等优点。通过实验证明，它是花生四烯酸含量测定的一种较理想的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生四烯酸油脂 嘉吉烯王生物工程(武汉)有限公司产品;花生四烯酸(ARA)甘油三酯、十三碳烷酸甘油三酯标准品 NU－CHEK公司;正庚烷 色谱纯;石油醚 沸程，30～60℃;氢氧化钾甲醇溶液(4mol/L)、花生四烯酸甘油三酯储备液(10mg/mL)、十三碳烷酸甘油三酯储备液(10mg/mL)。

Agilent6850气相色谱仪(火焰离子化检测器)。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 称取0.04g试样(精确至0.0001g)置于10mL容量瓶中，加入2.0mL十三碳烷酸甘油三酯内标储备液，加入适量正庚烷使溶解，并稀释至刻度，摇匀。准确吸取2mL正庚烷溶解液置于10mL带盖离心管中，加入0.2mL氢氧化钾－甲醇溶液，剧烈振荡1min以上，放置10min(甲基化反应)。如有机层浑浊，可离心使之澄清。取上清液进行气相色谱检测，进样量1μL。

1.2.2 色谱条件 色谱柱:DB－23毛细管柱(30m× 250μm×0.25μm);检测器为FID，温度300℃;柱温采用程序升温:90℃保持1min，以9℃/min升温到240℃保持5min，然后以3℃/min升温到250℃;检测器温度为300℃;载气为N2，氢气流速30mL/min，空气流速200mL/min;载气流速1.33mL/min;尾吹流量50mL/min。

1.2.3 标准溶液的配制 分别吸取适量的花生四烯酸储备液置于10mL的容量瓶中，并在每瓶中加入2mL的十三碳烷酸储备液，稀释定容使其花生四烯酸甘油三酯浓度分别为0、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0mg/mL，十三碳烷酸甘油三酯浓度为2.0mg/mL的标准液，备用。

2 结果与分析

2.1 甲酯化时间的选择

反应时间是影响甲酯化程度的一个重要因素，时间太短，甲酯化反应不够完全;时间太长，则影响了实验效率。因此本实验对不同时间下的响应值进行了比较，其结果见表1。

表1 不同甲酯化时间的响应值

从表1可以看出，当甲酯化的时间增加到1min后，响应值出现波动，之后延长时间没有明显的变化趋势，因此本实验选择甲酯化时间为不小于1min振摇时间。

2.2 氢氧化钾甲醇浓度的选择

氢氧化钾甲醇的浓度是影响甲酯化程度的另一个重要因素，本实验对不同浓度的氢氧化钾甲醇溶液进行了比较，结果见表2。

表2 加入不同浓度的氢氧化钾甲醇溶液时的响应值

从表2可以看出，选用4.0mol/L的氢氧化钾甲醇溶液时，甲酯化反应的效果最好，因此本实验选择氢氧化钾－甲醇溶液的浓度为4.0mol/L。

2.3 绘制标准曲线

分别吸取2mL标准液，置于10mL带盖离心管中，加入0.2mL氢氧化钾－甲醇溶液，剧烈振荡1min以上，放置10min，取1μL上清液进样。每一浓度进样三次，以标准工作溶液中花生四烯酸甘油三酯的浓度(mg/mL)为横坐标，以花生四烯酸/十三碳烷酸的峰面积比为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。

图1 花生四烯酸含量检测标准曲线

2.4 方法的准确度

分别称取0.1011g菜籽色拉油(1#)，1mL 10mg/mL花生四烯酸甘油三酯标准品(2#)，0.1314g菜籽色拉油加入5mL 10mg/mL花生四烯酸粉剂标准品(3#)，按1.2.1进行甲酯化操作，取上清液1μL，分别进样检测。

2#瓶ARA标品甲酯化后出峰时间17.956min;1#瓶色拉油甲酯化后在此附近的峰出峰时间分别有17.087min以及18.426min，离17.956min均较远，可判断此色拉油中无花生四烯酸成分。3#瓶色谱分析可得C13甲酯峰面积630.18132pA·s;ARA甲酯峰面积825.63816pA·s，由此可求得ARA脂肪酸质量m=0.04559g。加入色拉油中的 ARA乙酯质量为0.05g，转换成ARA脂肪酸的质量为0.05g×(304/ 332)=0.04578g，方法准确度可用回收率表示为99.58%。

2.5 方法的精密度2.5.1 仪器精密度 分别取2mL花生四烯酸、十三碳烷酸储备液，定容于10mL的容量瓶中，按1.2.1方法甲酯化。色谱分析，进样量1μL，重复六次。结果见表3。

表3 仪器精密度验证数据

从表3可以看出，对同一样品多次检测，十三碳烷酸/花生四烯酸响应值比的变异系数(RSD)为0.45%。

2.5.2 方法精密度 取3个25mL容量瓶，称取适量花生四烯酸油脂，按1.2.1处理后进行色谱分析，进样量为1μL。根据RSD评价花生四烯酸油脂含量分析方法实验的精密度。此实验重复三次，分三个工作日进行。结果如表4所示。

从表4中可以看出，对同一样品在不同时间内检测值的RSD为0.85%，小于2%。本方法精密度符合要求。

2.5.3 方法重现性 在“方法精密度验证”中，实验员A对ARA油剂按照1.2.1方法处理，得到的平均ARA%为40.66%。以下是另三名实验员在不同工作日对同一瓶样品按照1.2.1方法进行处理得到的数据。可根据RSD评价不同实验者的精密度。结果如表5所示。

从表5中可以看出，对同一样品在不同人员操作分析检测值的RSD为0.74%，小于2%。本方法精密度符合要求。

3 结论

使用本方法测定油脂中花生四烯酸的含量，回收率为99.58%，仪器精密度(RSD)为0.45%，方法精密度(RSD)0.85%，不同实验者精密度(RSD) 0.74%。实验结果表明，该方法准确，重现性好，简便易行，可用于油脂中常规ARA含量的检测。

表4 方法精密度验证数据

表5 方法重现性验证结果

［1］Singh G，Chandra R K.Biochemical and cellular efects of fish and fish oils［J］.Prog Food Nutr，1988，12:371－419.

［2］Evans C T，Ratledge C.Effect of nitrogen source on lipid accumulateion in oleaginous yeasts［J］.Journal of General Microbiology，1993，130:1693－1704.

［3］Horrobin D F，Huang Y S.The role of linoleic acid and its metabolites in theloweringofplasma cholesteroland the prevention of cardiovasallar disease［J］.Int J Ccardiol，1987，17: 173－180.

［4］可成有，吴晓芳.不饱和脂肪酸的气相色谱法同时测定［J］.中国卫生检疫杂志，2005，15(5):528－535.

［5］马文宏，张燕，薛刚，等.二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、亚油酸、亚麻酸和花生四烯酸(AA)在婴幼儿配方奶粉中的测定［J］.食品研究与开发，2007，28(8):142－144.

［6］李丽娜，汤华成，于长青.深黄被孢霉高产花生四烯酸菌株的微波诱变育种［J］.食品与生物技术学报，2009，28(1): 117－121.

Determination of the arachidonic acid in oil

TANG Xiao－peng，SU Min，ZHANG Yu－liang，XIAO Min
(Cargill Alking Bioengineering(Wuhan)Co.，Ltd.，Wuhan 420223，China)

Based on adding internal label，a method for determination of ARA oil had been established，the sample was methanol etherified by potassium hydroxide mixed with methyl hydrate，and then the methyl ester of aliphatic acid was separated by DB－23 capillary column.The results were:ARA recovery percent was 99.58%.The relative standard deviation(RSD)of precision of instrument and method was 0.45%and 0.85%，respectively.The relative standard deviation(RSD)of repeatability of method was 0.74%.This method was accurate and efficient for detecting ARA content and can meet reality demand.

internal standard method;arachidonic acid;gas chromatography

TS207.3

A

1002－0306(2011)12－0465－03

2011－09－06

唐孝鹏(1976－)，男，本科，从事油脂方向的研究工作。