乔 路, 周 大 勇, 李 秀 玲, 王 宏 海

( 1.大连工业大学 海洋食品教育部工程研究中心, 辽宁 大连 116034;2.大连工业大学 农业部农产品加工技术研发贝类专业分中心, 辽宁 大连 116034;3.中科院 大连化学物理研究所, 辽宁 大连 116023;4.浙江工商大学 水产品加工研究所, 浙江 杭州 310035 )

0 引 言

肽具有复杂的呈味功能,是高档复合调味品和香精香料的重要基料[1]。近年来研究者以低值鱼[2]、低值贝类[3]及豆类加工副产品[4]为原料,通过生物酶解技术制备呈味肽,为这些蛋白资源的高值化利用提供了思路。美拉德反应是非酶促褐变反应之一,主要是指食品中的氨基化合物(氨基酸、肽及蛋白质)与羰基化合物(糖类)发生的复杂反应。研究表明,肽经美拉德反应后能够明显提升鲜味、醇厚感和后味,且杂味较少,口味纯正[5]。同时,肽经美拉德反应后,表现出极强的抗氧化活性[6]。目前,采用美拉德反应处理肽制备高抗氧化性呈味物质的研究主要集中在植物来源的肽,而对海洋动物来源的肽相关研究较少。

作者所在课题组在前期研究中,以皱纹盘鲍废弃物——鲍鱼脏器为原料,通过生物酶解技术制备了呈味肽。在本研究中,通过美拉德反应处理鲍鱼脏器呈味肽,通过感官评定实验和体外抗氧化实验评价美拉德反应对鲍鱼脏器肽风味及抗氧化活性的影响,为鲍鱼脏器肽在食品中的应用提供了新思路。

1 实 验

1.1 材料、试剂与仪器

皱纹盘鲍(HaliotisdiscushannaiIno)脏器,大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供；木瓜蛋白酶,上海生工生物工程有限公司；胰蛋白酶,厦门星隆达化学试剂有限公司；中性蛋白酶,南宁庞博生物工程有限公司；集热式磁力加热搅拌器DF-101S型,江苏金伟试验仪器厂；LG-1.0型真空冷冻干燥机,沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；8050超滤搅拌器,Millipore France。

1.2 鲍鱼脏器肽的制备

新鲜鲍鱼脏器经清洗、匀浆、冻干、粉碎,过20目筛后得鲍鱼脏器干粉。分别采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶以表1所示条件水解鲍鱼脏器粉,酶解产物利用分子质量10 ku的超滤膜进行超滤分离,取分子质量小于10 ku的组分冷冻干燥得鲍鱼脏器肽。

1.3 美拉德反应

1.3.1 优化糖添加量

取中性蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽样品4.5 g溶于250 mL去离子水,混匀后取4份样品溶液(每份40 mL),各添加不同量的葡萄糖及木糖,使糖的终浓度分别为：A,木糖0.01 mol/L、葡萄糖0.04 mol/L；B,木糖0.02 mol/L、葡萄糖0.03 mol/L；C,木糖0.03 mol/L、葡萄糖0.02 mol/L；D,木糖0.04 mol/L、葡萄糖0.01 mol/L。各个样品中再添加10 mL去离子水,置于115 ℃高压锅中热反应1 h。反应完成后,样品经冷冻干燥得鲍鱼脏器肽美拉德反应产物。

1.3.2 优化反应温度

取中性蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽样品4.5 g溶于250 mL去离子水中,混匀后取3份样品溶液(每份40 mL),添加木糖和葡萄糖使其终浓度分别为0.02和0.03 mol/L。各个样品中再添加10 mL去离子水,分别置于110、115、120 ℃高压锅中热反应1 h。反应完成后,样品经冷冻干燥得鲍鱼脏器肽美拉德反应产物。

1.3.3 制备美拉德反应产物

取3种蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽各9 g,分别溶于500 mL去离子水中,混匀后添加木糖和葡萄糖使其终浓度分别为0.02和0.03 mol/L。各个样品中再添加125 mL去离子水,置于115 ℃高压锅中热反应1 h。反应完成后,样品经冷冻干燥得鲍鱼脏器肽美拉德反应产物。

1.4 感官评价实验

1.4.1 排序检验法[7]

将待评定样品溶于50 mL水中,使样品终质量浓度为2 mg/mL。每个待评价样品都随机3位数编号后,打乱顺序分别交给6名感官评定员进行风味评定,同一个样品每名品评员评价3次。品评员按风味优劣对样品进行排序,利用Friedman检验法分析处理感官评定数据。

1.4.2 风味剖析实验[8]

首先确定阈值范围。以纯水作参照物,阈值样品及纯水水温控制在50 ℃左右,反复比较并取10名感官评定人员品尝结果的平均值来确定鲜、咸、腥、苦4种味道的最低浓度即阈值,结果见表2。将待评定样品溶于50 mL水中,使样品终浓度为2 mg/mL。每个待评价样品都随机3位数编号后,打乱顺序交给10名评价员进行风味评定,同一个样品每名评价员评价3次。使用1～10点标度对品评样品进行打分,1=阈值=参照物,10=强度最大值,满分10分。

表2 感官评定阈值参照表

1.5 抗氧化活性

1.5.1 二苯代苦味酰自由基(DPPH自由基)清除作用[9]

取2 mL不同浓度的样品溶液,加入2 mL 1×10-4mol/L的DPPH溶液,混匀后在室温下避光反应20 min,并在4 000 r/min下离心10 min,以95%的乙醇调零,在517 nm处测定上清液的吸光度As,同时测定2 mL 95%的乙醇与2 mL样品溶液混合后的吸光度A0以及2 mL DPPH溶液与2 mL去离子水混合后的吸光度A。

按公式(1)计算清除率。以维生素C(VC)作为阳性对照。以半数清除浓度(IC50)值表示样品对DPPH自由基的清除能力。IC50值是利用线性回归方程计算出样品对DPPH自由基清除率为50%时对应的样品质量浓度(mg/mL)。

清除率=[1-(As-A0)/A]×100%

(1)

1.5.2 清除羟自由基能力[10]

按顺序分别取0.15 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.4)1.0 mL,520 μg/mL的番红溶液0.2 mL,6 mmol/L的EDTANa2-Fe2+1.0 mL,不同浓度的样品溶液7.0 mL,混匀,最后加入0.3%的H2O20.8 mL启动反应,于40 ℃水浴保温30 min,并在4 000 r/min下离心10 min,在波长520 nm处测上清吸光度值As。空白样品(A0)以等体积的去离子水代替样品溶液,对照样品(A)以等体积的去离子水代替样品溶液和H2O2溶液。

按公式(2)计算清除率。以VC作阳性对照。以IC50值表示样品对羟自由基的清除能力。IC50值是利用线性回归方程计算出样品对羟自由基清除率为50%时对应的样品质量浓度(mg/mL)。

清除率=[1-(As-A0)/(A-A0)]×100%

(2)

1.5.3 还原活性测定[11]

取0.25 mL不同浓度的样品,加入0.2 mol/L的磷酸缓冲液(pH 6.6)1.0 mL,1%铁氰化钾[K3Fe(CN)6]溶液1.0 mL,混匀,在50 ℃下保温20 min。再加入10%三氯乙酸(TCA)溶液1.0 mL,振荡混匀后在4 000 r/min下离心10 min。取上清液2.5 mL,再加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的三氯化铁(FeCl3)溶液,静置10 min后体系溶液由黄色变为蓝色,在700 nm下测吸光度值(A700)。吸光值越大,样品的还原能力就越强。空白样品以等体积去离子水代替样品溶液,以VC作为阳性对照,以A700=0.7值表示样品的还原能力,A700=0.7值是利用线性回归方程计算出反应体系在700 nm下测得吸光度值为0.7时对应的样品质量浓度(mg/mL)。

1.6 统计方法

数据的统计分析借助SPSS 15.0 分析软件(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)实现。组间差异性检验采用单因素方差分析中的LSD法完成。

2 结果与讨论

2.1 美拉德反应条件的确定

2.1.1 糖添加量

在美拉德反应中,不同还原糖的反应活性不同,相应反应产物的风味也会出现差异[12]。本研究以中性蛋白酶制备的呈味肽为原料,组合使用了不同浓度的葡萄糖和木糖,制得了4个美拉德反应产物。6名感官评定人员对这4个样品的风味进行了评价,并根据评价结果对其进行排序,实验结果如表3所示。对表3的感官评价数据进行Friedman检验法分析,结果表明样品之间存在显著差异(P<0.05),说明采用不同糖配比组合制备的美拉德反应产物的感官风味强度具有显著差异。当木糖和葡萄糖添加量分别为0.02和0.03 mol/L时(组合B),鲍鱼脏器肽美拉德反应产物的风味最好。张彩菊等[13]以鳙鱼的酶解产物为基料,组合使用葡萄糖和木糖(葡萄糖与木糖的质量比为1∶2.5)进行美拉德反应后,能产生最逼真鱼香味的美拉德反应产物。

2.1.2 反应温度

反应温度是美拉德反应的一个非常重要的条件参数,对美拉德反应产物的风味影响巨大[1]。在本研究中,使用3个不同的反应温度制得了相应的美拉德反应产物。6名感官评定人员对这3个样品的风味进行了评价,并根据评价结果对其进行排序,实验结果如表4所示。对表4的感官评价数据进行Friedman检验法分析,结果表明样品之间存在显著差异(P<0.05),说明采用不同反应温度制备的美拉德反应产物的感官风味强度具有显著差异。当反应温度为115 ℃时,产物的风味最好。张彩菊等[13]以鳙鱼的酶解产物为基料,进行美拉德反应制备调味料时,最佳的反应温度也是115 ℃。

表4 不同反应温度制得的美拉德反应产物品评员的评价结果

2.2 美拉德反应产物的风味剖析

课题组在前期研究中,采用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解鲍鱼脏器制备鲍鱼脏器呈味肽。感官评价结果表明,中性蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽口味最好[14]。在本研究中,分别制备了上述3种鲍鱼脏器肽的美拉德反应产物,美拉德反应条件如下：肽质量浓度为14.4 g/L；添加木糖和葡萄糖使其终浓度分别为0.02和0.03 mol/L；反应温度为115 ℃；反应时间1 h。将各个肽的美拉德反应产物与中性蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽采用风味剖析法进行了感官评定,10名品评员的品评结果见表5。从表5可见,3种酶制备的鲍鱼脏器肽的美拉德反应产物的总体风味都显著好于中性蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽,这说明美拉德反应能显著提升蛋白水解肽的风味。在3种美拉德反应产物中,来源于中性蛋白酶的样品风味最好,其原因可能是由于其原料肽的呈味氨基酸含量最高、风味最好[14]。进一步品评各个样品的鲜、咸、腥、苦4种主要风味,发现肽经美拉德反应后味道更鲜,咸度适当,但腥、苦等不良味觉较弱。

Ogasawara等[15]的研究表明,大豆水解肽(1～5 ku)经美拉德反应后,其总体风味得到明显提升,将这种美拉德反应产物作为调味料加入到清汤中,汤的鲜味、口感延续性及口感厚度等方面都得到显著改善。美拉德反应提升水解肽风味的原因是由于在美拉德反应中会产生酚类、酯类、酮类、醛类、羧酸类及杂环类等多种风味物质[2]。

表5 风味剖析实验结果

2.3 抗氧化活性

研究表明,肽具有普遍的抗氧化活性[6,17]。肽经美拉德反应后,其抗氧化活性显著增强[18]。本研究通过DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验以及还原活性实验评价了中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制备的鲍鱼脏器肽以及这3种肽的美拉德反应产物的体外抗氧化活性,实验结果如表6所示。从表6可以看出,鲍鱼脏器肽均具一定的DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性和还原能力,但活性强度均远远低于阳性对照VC。鲍鱼脏器肽经美拉德反应处理后,DPPH清除活性增强百倍以上,活性强度接近于VC,而羟自由基清除活性及还原能力也增强数十倍,活性强度强于或接近于VC。在美拉德反应中,可生成类黑素(melanoidins)类物质,这是一类聚合度不等的高分子混合体,具有极强的抗氧化活性,是美拉德反应产物抗氧化活性显著增强的原因之一[18]。

表6 鲍鱼脏器肽美拉德反应前后的抗氧化活性

3 结 论

在14.4 g/L的鲍鱼脏器肽溶液中添加木糖和葡萄糖使其终浓度分别为0.02和0.03 mol/L后,于115 ℃下反应1 h制得的美拉德反应产物的风味最佳。与反应前相比,鲍鱼脏器肽美拉德反应产物的鲜味增强,腥味及苦味减弱,总体风味显著提升,DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性及还原活性也增强数十倍甚至上百倍。

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