汪立芹，刘晨曦，王 静，黄俊成

(1.新疆动物生物技术重点开放实验室，乌鲁木齐 830000;2.农业部草食家畜繁育生物技术重点开放实验室，乌鲁木齐 830000)

卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法

汪立芹1，2，刘晨曦1，2，王 静1，2，黄俊成1，2

(1.新疆动物生物技术重点开放实验室，乌鲁木齐 830000;2.农业部草食家畜繁育生物技术重点开放实验室，乌鲁木齐 830000)

目的 提高并稳定转基因绵羊生产效率。方法 采用卵周隙内注射慢病毒的方法生产转基因绵羊。比较了不同发育阶段卵母细胞注射慢病毒对其后期发育及基因表达的影响，对照了注射不同慢病毒剂量以及不同熟练程度人员操作，对胚胎发育及基因表达率的影响。结果 (1)受精前或受精后注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率没有影响(P＞0.05);(2)在受精后的单细胞注射或者2～4细胞期注射慢病毒对胚胎后期发育和阳性率也都没有影响(P＞0.05);(3)慢病毒注射剂量在50～100 pL之间对转基因效率没有影响(P＞0.05);(4)操作人员的熟练程度不影响胚胎成活率和转基因效率(P＞0.05)。结论 建立了卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊的方法，并使转基因胚胎阳性率稳定在70%以上。

转基因;慢病毒;绵羊卵母细胞

1 材料方法

1.1 卵母细胞的获取

本实验所用卵巢皆取自乌鲁木齐市华凌屠宰场，宰杀半小时内的绵羊卵巢，放入温度为30℃左右的加有青霉素(1000 IU/mL)和链霉素(1000 IU/mL)的灭菌生理盐水中，3 h内运回实验室，灭菌生理盐水清洗3次，用连有12G针头、吸有1 mL吸卵液的10 mL注射器抽吸卵巢表面直径为2～5 mm的卵泡，在体视显微镜下选择含有完整卵丘细胞层、胞质均匀的卵母细胞，用于体外成熟(IVM)。

本实验所用试剂除特别注明外，皆购自 Sigma公司。

吸卵液成份为：TCM199-Hepes+1 mg/mL PVA+0.7 mg/mL肝素钠(中国)。

1.2 卵母细胞的体外成熟

卵母细胞用吸卵液和成熟液各洗2次，以25～30枚/滴的密度放入 75 μL成熟液滴中，置于38.6℃、5%CO2、饱和湿度的 CO2培养箱内进行成熟培养。

成熟液成分为：TCM199-HCO3+10% FBS(Gibco)+0.05 IU/mL FSH+0.05 IU/mL LH+1 μg/mL estradiol+ 24.2 mg/L sodium pyruvate +100 IU/mL双抗。

1.3 卵母细胞的体外受精

受精前3 h将加有500 μL受精液的圆底试管、2.5 mL受精液、50 μL/滴的受精液滴盘放入CO2培养箱内平衡。

1.3.1 卵母细胞的准备：将体外成熟24～26 h的卵母细胞放入0.1%透明质酸酶内，轻轻吹打以除去部分或全部颗粒细胞，用受精液充分洗涤3次，按20～25枚/滴的密度放入平衡好的50 μL受精液滴内。

1.3.2 精子的制备：使用上游法进行精子处理。在39℃水浴内解冻绵羊颗粒冻精，把解冻的精液加入平衡好的500 μL受精液离心管底部，放入培养箱中上游20 min后，将上层精子混悬液移入离心管，以1500 r/min的转速离心5 min，将底部精子沉淀加入1 mL受精液再次离心洗涤，弃大部分上清，留约100 μL沉淀，移液枪轻轻吹打混匀，进行精子计数;根据精子密度要求，将稀释好的精子混悬液加入受精液滴内与卵母细胞共同孵育。

受精液成分为：SOF+20%发情羊血清(自制)+6 IU/mL肝素钠+100 IU/mL庆大霉素。

1.4 受精卵的体外培养

精-卵共同孵育18 h后，用平衡3 h的体外培养液反复吹吸受精卵，以除去颗粒细胞及黏附于颗粒细胞上的精子，洗涤3遍后，以50～80枚/孔的密度移入平衡好的四孔培养板内，在38.6℃、5%CO2、5%O2，90%N2、饱和湿度的密封气袋内进行体外培养;受精7 d统计囊胚率。培养液的成分为：SOF+3 mg/mL BSA。

1.5 慢病毒的制备

如王淑艳等［11］所述，将慢病毒载体与病毒包装质粒共同转染293T细胞，48 h后收集上清超速离心，进行病毒浓缩。经测定病毒滴度为1.5 ×109TU/μL。

1.6 转基因胚胎的构建

按照显微操作方法将卵母细胞固定，显微注射针吸取足够量的慢病毒，轻轻刺破透明带，将一定量的慢病毒缓慢注射进透明带下。

1.7 阳性胚胎的鉴定

胚胎培养至第7天，用蓝色荧光照射胚胎，带有绿色荧光胚胎的定为阳性胚胎。

1.8 数据分析

本实验数据全部采用SPSS 11.5统计软件的one-way ANOVA进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 绵羊卵母细胞在受精前或受精后注射慢病毒对胚胎发育及阳性率的影响

卵母细胞体外成熟24 h后，随机分为三组，一组卵母细胞在0.1%的透明质酸酶内处理30 s，缓慢吹吸，脱去颗粒细胞，将慢病毒注射进透明带下，然后进行体外受精，受精12 h后，移入体外培养液;一组卵母细胞直接进行体外受精，受精12 h，脱去黏附于胚胎的全部颗粒细胞，将慢病毒浓缩液注射入透明带下，然后放入培养液培养;一组卵母细胞体外受精后直接放入培养液，作为对照组。培养36 h后统计卵裂率，第7天统计囊胚率和阳性率。实验结果如表1所示：卵母细胞受精前、后注射慢病毒浓缩液，对卵裂率(84.99%，81.16%，84.71%)和囊胚率(16.09%，18.36%，18.05%)都没有影响(P＞0.05)。因此，受精前、后的卵母细胞皆可用于卵周隙内注射慢病毒生产转基因绵羊。注射慢病毒浓缩液的胚胎经荧光照射前后见图1(封三)。

表1 卵母细胞受精前、后注射慢病毒对胚胎发育和转基因效率的影响(重复3次)Tab.1 The influence of injecting lentiviral vector into oocytes or embryos on the embryonic development and transfection efficacy(each experiment repeated 3 times)

2.2 受精后单细胞与2～4细胞期胚胎注射慢病毒对胚胎发育及阳性率的影响

将受精12 h的假定胚胎随机分为两组，一组注射慢病毒后继续培养，一组培养至36 h时选择2～4细胞期胚胎注射慢病毒后，入原滴培养，第7天统计囊胚率和阳性率(表2)，结果表明：无论是单细胞还是2～4细胞期的胚胎注射慢病毒后囊胚率和基因表达率都没有差异(P＞0.05)。

2.3 慢病毒剂量对胚胎后期发育、阳性率及强弱比的影响

卵母细胞成熟培养24 h，去除大部分颗粒细胞后，随机分为两组，一组注射滴度为1.5×109TU/μL的病毒浓缩液约100 pL，另一组注射约50 pL，随后进行 IVF-IVC。结果如表 3所示，卵裂率、囊胚率、阳性率及阳性胚胎中荧光强度间皆没有差异(P＞0.05)。

表2 受精后不同发育阶段胚胎注射慢病毒对基因表达的影响(重复3次)Tab.2 The influence of injecting lentiviral vector at different developmental stages on the gene expression in the embryos(each experiment repeated 3 times)

表3 注射不同剂量慢病毒浓缩液对胚胎发育及阳性率的影响(重复3次)Tab.3 The influence of lentiviral vector injection in different doses on the embryo development and positive rate(each expeiment repeated 3 times)

2.4 操作人员熟练程度对胚胎阳性率的影响

本实验将卵母细胞随机分为两组，一组由显微操作不熟练的人员注射，另一组由熟练人员操作，结果如表4所示，除操作时间比熟练人员长以外，对胚胎发育及阳性率皆没有影响(P＞0.05)，因此，该方法可以被广泛使用。

表4 不同操作人员操作对胚胎阳性率的影响(重复2次)Tab.4 The influence of the proficiency of operators for lentiviral vector injection on the positive rate of embryos(each experiment repeated 2 times)

3 讨论

慢病毒载体(lentivirus vectors)与简单的逆转录病毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞，转移基因片段容量较大，目的基因表达时间长，不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前制备转基因动物的载体之一［12］。

不同实验室用慢病毒载体制备转基因动物所选择的胚胎时期不一样，有的用受精前的成熟卵母细胞［4］，有的用受精后的单细胞胚胎［3，7］，都获得了转基因动物。但是否任何发育时期的胚胎都适合于使用慢病毒载体制备转基因绵羊的方法还未见报道。本实验分别比较了体外成熟培养后的卵母细胞和受精后单细胞、2～4细胞期胚胎注射慢病毒浓缩液后对其后期发育及转基因效率的影响，结果表明，无论注射后受精还是受精后注射慢病毒浓缩液，都不影响胚胎的后期发育，进一步验证了慢病毒具有可感染分裂细胞及非分裂细胞的特性。但本实验只研究了4细胞期前的胚胎，对其后的16细胞期、桑椹期、囊胚期胚胎注射慢病毒浓缩液后胚胎发育率和转基因效率是否有影响还需进一步研究。

慢病毒浓缩液是低毒性的，注射剂量对胚胎发育和基因表达是否有影响，还没有确切的结论。从已获得的转基因动物实验中看，注射剂量在10 pL至150 pL不等。本实验比较了注射剂量为50 pL和100 pL两组，实验结果表明，绵羊卵母细胞卵周隙内注射50 pL或者100 pL滴度为1.5×109TU/μL的慢病毒浓缩液对胚胎后期发育和转基因效率没有显著影响。因此，对于1.5×109TU/μL滴度的慢病毒而言，注射剂量在50 pL～100 pL之间是合适的。

核移植、单精子显微注射、原核注射是以往常用的转基因方法中，它们对显微操作人员要求很高，必须在很短的时间内完成所有的工作，否则对胚胎的伤害很大，影响后期发育，这也是转基因效率低下的原因之一，而卵周隙内注射慢病毒的工作，对操作熟练程度的要求就相对简单，只需将针轻轻扎破透明带，不会伤害细胞质膜，即使操作速度较慢，也不会影响胚胎的存活率，因此，卵周隙内注射慢病毒浓缩液制备转基因动物的方法适合于一般实验室，操作人员只需要掌握基本的显微操作方法。

本实验室利用该方法，将通过超数排卵、人工授精、手术回收的受精后2～8细胞期胚胎注射慢病毒浓缩液后，移植给受体的方法，共生产转基因胚胎473枚，移植受体255只，怀孕母羊118只，出生162只羔羊，通过检测有92只为转基因羔羊，平均转基因效率达56.8%，是迄今为止，获得转基因绵羊最多的一次实验。再次证明卵母细胞卵周隙内注射慢病毒是高效率的转基因方法。

(本文图1见封三。)

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Establishment of a technique to generate transgenic sheep by perivitelline injection of lentivirus vector

WANG Li-qin1.2，LIU Cheng-xi1.2，WANG Jing1.2，HUANG Jun-cheng1.2
(1.Key Laboratory of Animal Biotechnology of Xinjiang，Urumqi 830000，China;2.Key Laboratory of Grass Livestock Reproduction and Breed Biotechnology，Ministry of Agriculture，Urumqi 830000)

Objective To explore a technique to improve the efficacy of generation of transgenic sheep by injection of lentivirus into the perivitelline space of oocytes.Methods Recombinant EGFP lentivirus was injected into the perivitelline space of oocytes.The growth status and gene expression of oocytes at different stages of embryonic development were assessed to analyze whether the injection doses of the lentivirus or the skill of different operators influence the embryonic development.Results (1)The lentivirus injection before or after fertilization of oocytes had no significant influence on the embryo development and gene expression(P＞0.05);(2)After fertilization，the lentivirus injection into single firtilized cell or 2-4-cell embryos did not affect the embryonic development and gene expression;(3)Lentivirus injected in a dose of 50 pL to 100 pL did not affect the transfection efficacy(P＞0.05);(4)The proficiency of operators did not affect the embryo survival rate and transfection efficacy(P＞0.05).Conclusions A method of generation of transgenic sheep by injecting lentiviral vector into perivitelline space has been established，with a stable positive rate of transgenic embryos higher than 70%.

Transgenic;lentiviral vector;sheep oocyte

Q95-33，R-33

A

1005-4847(2011)01-0012-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.003

目前，生产转基因动物的方法有原核内显微注射法、精子载体法、脂质体转染法、反转录病毒载体法、以及细胞核移植方法，但这些方法皆因成本高、转基因效率低或者插入片段小等缺点而无法广泛应用［1］。慢病毒载体法的出现，不仅克服了以往逆转录病毒表达沉默的缺陷，而且转基因的效率远远高于传统的显微注射法，是转基因动物研究领域的突破性进展［2］。随后，利用该方法，已经有转基因猪［3，4］、转基因牛［5］、转基因鼠［6，7］、转基因鸡［8］、绵羊［9］、猕猴［10］等出生。但在以往的研究中，只是获得了少量的转基因动物，并且也未见系统研究慢病毒注射的胚胎时期等因素是否会影响转基因效率和后期发育的报道，本研究即采用卵周隙内注射慢病毒的方法，比较了不同发育阶段绵羊卵母细胞、注射不同剂量慢病毒浓缩液、不同熟练程度操作人员等因素对转基因效率及胚胎发育的影响，以期获得稳定、高效的利用慢病毒制备转基因绵羊的方法。利用此方法，本实验室在2010年3月，获得了92只转基因羔羊。

国家转基因重大专项(编号：2008ZX08008-003;2008ZX08008-001-3;2008ZX08010-004-008)。

汪立芹(1981-)，女，江苏人，助理研究员，研究方向：动物生物技术。E-mail：wlq6304@126.com

黄俊成，博士，研究员，硕导，主要从事动物生殖与发育研究。E-mail：h_jc@sina.com

2010-08-30