张 万 忠， 杜 金 峰，， 王 云 山， 苏 志 国，

（1．沈阳化工大学 环境与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142；

2．中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190）

玉米秸秆酶解条件优化

张 万 忠1， 杜 金 峰1，2， 王 云 山2， 苏 志 国1，2

（1．沈阳化工大学 环境与生物工程学院，辽宁 沈阳 110142；

2．中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室，北京 100190）

考察了玉米秸秆的酶解条件对纤维素酶解率的影响，分析了纤维素酶浓度、温度、p H、酶解时间和固液比对玉米秸秆酶解的影响，比较了分批加酶和分批水解两种方式的玉米秸秆纤维素酶解率。结果表明，采用纤维素酶水解玉米秸秆超细粉，对纤维素的酶解条件进行优化，确定最佳酶解工艺条件为：加酶量30 U／g（对纤维素干重），固液比1∶10，温度55℃，p H 4．8，酶解时间48 h；通过分批加酶和分批水解的方式可以提高酶解率，当加酶3次和分批水解3次时，酶解率分别达到了33．42%和27．50%。

玉米秸秆；纤维素酶；酶解率

0 引 言

近年来，由于石油等一次性矿物资源的加速消耗以及环境污染的日益加剧，燃料乙醇作为安全、洁净的燃料及汽油添加剂已经倍受关注，燃料乙醇的需求量呈不断上升的趋势［1］。我国作为木质纤维素生产大国，如将其与各种形式的木质纤维素考虑其中，每年木质纤维素产量高达10亿吨，纤维素可被纤维素酶水解为葡萄糖等可发酵糖，通过发酵成为乙醇、丙酮等化工原料，实现植物纤维类物质特别是农业废弃物的转化利用研究，具有缓解能源危机，减少环境污染，维持人类可持续发展的意义［2］。

木质纤维素原料的结构较复杂，直接对其进行糖化或生物转化十分困难，为了提高木质纤维素水解液葡萄糖的质量浓度和酶解率，降低糖的损失，木质纤维素的预处理是非常必要的［3］。预处理后需进行纤维素的糖化，将纤维素水解糖化为葡萄糖等可发酵性糖类。常用的水解工艺包括酸水解工艺和酶水解工艺［4－5］。酸水解工艺需要加酸，反应条件剧烈，对设备要求较高，具有较强的腐蚀性，易产生对微生物发酵有毒害作用的副产物，不利于后续的清洁燃料发酵研究，且回收酸需要花费大量时间和成本。酶水解工艺反应条件温和，副产物少，对环境污染小，不需要添加化学试剂，是较有发展前景的水解工艺。

目前，纤维素水解糖化最主要的问题是酶解效率低，酶解周期长，酶用量大，转化率不高等方面，这些问题严重制约了木质纤维原料的生物转化和利用［6］。本实验通过对超细粉碎玉米秸秆酶水解过程中纤维素酶浓度、温度、p H、酶解时间和固液比进行研究，考察了玉米秸秆分批加酶和分批水解对酶解率的影响，为玉米秸秆发酵生产清洁燃料的工艺优化提供依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

玉米秸秆：产自北京郊区，将自然风干的玉米秸秆切成3～4 cm长段，并放入超细粉碎机中粉碎，粉碎后为100～200目秸秆粉。

纤维素酶：宁夏夏盛实业集团有限公司，滤纸酶活为 83 U／m L，酶活定义为［7］：在 50 ℃、p H 4．8条件下，每分钟水解1 cm×6 cm的滤纸，产生1μmol葡萄糖所需酶量为1酶活单位。

1．2 仪器与设备

TS－2102新型恒温培养振荡器，上海天呈实验仪器制造有限公司；Anke TGL－16C台式离心机，上海安亭科学仪器厂；SBA－40E生物传感分析仪，山东省科学院生物研究所。

1．3 实验方法

称取处理后的干燥玉米秸秆粉，按照一定的固液比置于250 m L三角瓶中，调节底物混合物的p H，加入一定量的纤维素酶，在转速为100 r／min的摇床中振荡水解，每隔12 h取样离心，测定葡萄糖含量，直至葡萄糖含量增加缓慢。

1．4 分析方法

葡萄糖的测定采用生物传感仪分析法［8］。纤维素酶解率按下式计算［9］：

式中，m0和m1为水解后葡萄糖的质量（g）和秸秆干重（g）；w1为纤维素所占秸秆干重的质量分数。

2 结果与分析

2．1 加酶量对玉米秸秆酶解的影响

在木质纤维素的酶法水解工艺中，纤维素酶的成本是决定酶解能否经济可行的关键因素［10］，降低纤维素酶的成本有两个方面：降低纤维素酶的生产成本或是尽可能减少纤维原料酶解过程中纤维素酶的用量，因此确定纤维素的酶量十分重要。本实验选择超细粉碎秸秆，在底物浓度1∶10固液比条件下，研究了每克纤维素分别加入5、10、20、30、40、50和60 U 对酶解的影响，结果如图1所示。

图1 加酶量对玉米秸秆酶解的影响Fig．1 Effect of cellulase concentration on enzymatic hydrolysis of corn stover

从图1可以看出，随着加酶量的增大，纤维素酶解率持续增加，在加酶量为30 U／g纤维素时，酶解率为25．23%。加酶量大于30 U／g纤维素干重时，随着纤维素酶浓度的增大，酶解率增长缓慢，说明当纤维素酶分子达到一定水平时，纤维素酶可触及纤维素的位点接近饱和，再加入纤维素酶酶解率增长缓慢。为了经济有效的利用纤维素酶，选择纤维素酶量为30 U／g纤维素。

2．2 温度对玉米秸秆酶解的影响

选择45、50、55和60℃4个温度梯度，酶解48 h，结果如图2所示。

图2 温度对玉米秸秆酶解的影响Fig．2 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis of corn stover

由图2可以看出，随着温度的升高，纤维素酶解率逐渐升高，在温度为55℃时，酶解率达到最高，为22．71%。而随着温度的继续增加，葡萄糖酶解率呈下降趋势，说明纤维素酶在温度过高和过低时都不能完全发挥它的作用，温度过低纤维素酶不能完全利用，温度过高则纤维素酶遭到破坏，发生不可逆性失活，酶活力降低，使纤维素水解玉米秸秆酶解率降低，所以纤维素酶水解玉米秸秆的最佳温度为55℃。

2．3 pH对玉米秸秆酶解的影响

纤维素酶的活性受其环境p H的影响，一般纤维素酶的最适p H在4．4～5．0，本实验将p H设为4．2、4．5、4．8、5．1、5．4共5个梯度来观察p H对玉米秸秆酶解的影响，结果如图3所示。

图3 pH对玉米秸秆酶解的影响Fig．3 Effect of pH on enzymatic hydrolysis of corn stover

由图3可以看出，在一定范围内p H对玉米秸秆酶解的影响并不十分明显，随着p H的增大，纤维素酶解率逐渐增加，在p H增大到4．8时，酶解率达到最大值，为24．32%。p H大于4．8时酶解率有所降低，说明在玉米秸秆水解液过酸或过碱的情况下，都会使纤维素酶失活，因为在酶分子的活性部位上具有很多酸性或碱性氨基酸的侧链基团，可随着p H的变化而发生解离，因此本实验将玉米秸秆酶解的最适p H设为4．8。

2．4 酶解时间对玉米秸秆酶解的影响

纤维素酶水解过程复杂，本实验选择底物浓度固液比为1∶10，p H为4．8，考察了酶解时间对纤维素酶解率的影响，如图4所示。由图4可见，随着玉米秸秆酶解时间的延长，纤维素酶解率持续增加，在前12 h酶解率增加较快，12 h后酶解率开始增加缓慢，48 h酶解率达到了22．65%，60 h时酶解率为23%，酶解时间从48 h增加到60 h，酶解率仅增加了1．55%。因为在水解过程中，纤维素非结晶区和无定形区首先被纤维素酶水解，随着水解的进行，其所占的比例逐渐减小，导致纤维素酶解率增加缓慢，酶解率在48 h后增加缓慢，所以选择酶解时间为48 h。

图4 酶解时间对玉米秸秆酶解的影响Fig．4 Effect of time on enzymatic hydrolysis of corn stover

2．5 固液比对玉米秸秆酶解的影响

固液比直接影响到底物浓度、葡萄糖质量浓度及纤维素酶分子浓度，因而对酶水解具有极为重要的影响。本实验将初始固液比设置为0．5∶10、1．0∶10、1．5∶10、2．0∶10，酶解48 h，结果如图5所示。

图5 固液比对玉米秸秆酶解的影响Fig．5 Effect of solid－liquid ratio on enzymatic hydrolysis of corn stover

从图5可以看出，随着固液比的增大，葡萄糖质量浓度逐渐增加，纤维素酶解率逐渐降低。固液比较小时，葡萄糖质量浓度较低，用于后续发酵时浓缩倍数较大，导致不利于菌种生长的抑制物浓度增大，影响后续发酵；而提高固液比虽有助于获得较高的葡萄糖质量浓度，但水解液中秸秆浓度过大，产生的搅拌和传质阻力增大，不利于酶与纤维素的结合，酶解率降低。综合考虑葡萄糖质量浓度、酶解率和对后续发酵的影响，选择最佳固液比1∶10，此时葡萄糖质量浓度为8．32 g／L，酶解率为24．1%。

2．6 分批加酶对玉米秸秆酶解的影响

在纤维素酶解过程中，由于纤维素酶活力的降低和纤维素酶与木质素吸附等所造成的消耗，需要中途补充纤维素酶，以使纤维素充分水解，本实验考察分批加入纤维素酶对玉米秸秆酶解的影响，每48 h加酶一次，加4次，结果如图6所示。

图6 分批加酶对玉米秸秆酶解的影响Fig．6 Effect of fed－batch enzyme on enzymatic hydrolysis of corn stover

从图6可以看出，葡萄糖质量浓度和纤维素酶解率随着加酶次数的增加而增加，随着酶解过程中纤维素的水解和纤维素酶的加入，未水解纤维素所占比例逐渐减少；同时纤维素酶与纤维素接触位点逐渐达到饱和，在加酶3次，酶解时间72 h时，酶解率和葡萄糖质量浓度分别达到了33．42%和11．55 g／L。

2．7 分批水解对玉米秸秆酶解的影响

为了将纤维素完全水解，提高纤维素水解的酶解率，将玉米秸秆酶解后离心，再将水解残渣按照固液比1∶10的比例进行水解，依次水解4次，结果如图7所示。

图7 分批水解对玉米秸秆酶解的影响Fig．7 Effect of fed－batch hydrolysis on enzymatic hydrolysis of corn stover

从图7可以看出，随着水解次数的增多，酶解率逐渐增加，分批水解前3次酶解率增加显著，第3次酶解率达到了27．50%，在第4次水解过程中，酶解率增加量较少，仅增加了0．11%，说明超细秸秆在3次水解后不会再有葡萄糖的产生。

3 结 论

通过对玉米秸秆超细粉酶解条件的研究，确定了一种最佳酶解工艺条件，并考察了玉米秸秆超细粉的最高酶解率。

（1）通过对超细粉碎玉米秸秆酶解条件的工艺优化，确定了酶解的最佳工艺条件：加酶量为30 U／g（对纤维素干重），固液比为1∶10，温度为55℃，p H为4．8，酶解时间为48 h。

（2）选择超细玉米秸秆，采用分批加酶和分批水解的方式得到较高的酶解率，在加酶3次和分批水解3次时纤维素酶解率分别达到了33．42%和27．50%，得出通过分批加酶的方法得到的酶解率较高。

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Enzymatic hydrolysis of corn straw

ZHANG Wan－zhong1， DU Jin－feng1，2， WANG Yun－shan2， SU Zhi－guo2
（1．College of Environment and Biology，Shenyang University of Chemical Technology，Shenyang 110142，China；
2．State Key Laboratory of Biochemical Engineering，Institute of Process Engineering，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190，China）

The effect of cellulase concentration，temperature，p H，reaction time and solid－liquid ratio on hydrolysis rate was studied and the hydrolysis rate of batch feed enzyme and batch enzymatic hydrolysis was compared．The optimum condition was 30 U／g cellulase，1∶10 of liquid－solid ratio，55℃，p H 4．8 for 48 h．Both batch feed enzyme and batch enzymatic hydrolysis could improve hydrolytic rate．Hydrolytic rate could reached to 33．42%and 27．50%，respectively after third feeding cellulase enzymatic and batch enzymatic hydrolysis three times．

corn straw；cellulase；enzymolysis rate

TS210．9；TK6

A

1674－1404（2011）06－0436－04

2011－04－11．

中科院知识创新工程重大项目（KSCX1－YW－11D2）．

张万忠（1968－），男，教授．