邹伟，王珑，李丹，孙晓伟，孔莹

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001)

ICH是一种由于脑血管变性或破裂，大量血液渗入脑实质内，导致脑组织肿胀、充血、软化引起的急性脑血管病。近年来许多研究表明，ICH继发性脑损伤是出血性脑损伤的主要原因，ICH后血脑屏障被破坏形成脑水肿，脑水肿是脑组织开始损伤及后续损伤严重性的一个标志［1］。本研究旨在观察头穴透刺对ICH后炎症反应过程中发挥重要作用的NF－κBp65表达的影响及其与脑水肿发生的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验采用清洁级Wistar雄性大鼠，总计96只，体质量(350±20)g，动物于人工控制条件下饲养，保持室温20℃，光照持续14h，黑暗10h。实验前正常饲养1周，造模大鼠术前禁食12h，禁水6h。

1.2 实验方法［2］

1.2.1 实验动物分组

健康雄性Wistar大鼠96只，采用完全随机化设计，将其中90只随机分为模型组、针刺组和西药组，每组再按6h、1天、2天、3天、7天5个时间点随机分为5个亚组，每个亚组6只大鼠，各亚组均建立ICH模型;另6只正常大鼠设为空白组。

1.2.2 ICH 模型的建立

参照邹氏法制作ICH大鼠模型［3］。

1.2.3 实验动物的干预方法

空白组:不做任何干预措施。

针刺组:造模后，立即给予针刺治疗(1次/天，30min/次);并给予类西药组lml生理盐水灌胃(3次/天)。具体针刺方法:俯卧位捆绑固定大鼠，取病灶侧百会进针，用华佗牌28号1寸毫针透刺曲鬓，进针约0.8寸，留针30min，采用捻转行针手法，其间捻转3次，每次2min，以200转/min速度捻针。

西药组:造模后，给予lml茴拉西坦稀释液灌胃治疗，3次/天;并给予类针刺组捆绑30min/天。

模型组:造模后，给予类西药组lml生理盐水灌胃，3次/天;并给予类针刺组捆绑30min/天。

1.2.4 指标测定

1.2.4.1 脑水含量的测定方法 参照干湿比重法进行。

1.2.4.2 Western 蛋白免疫印迹法检测

将脑组织标本研磨成粉状，每100mg组织中加入1ml RIPA 和 10ul PMSF，冰上匀浆，于 4℃、12 000r/min条件下离心20min，快速取上清，测定目的蛋白浓度，之后制备10%浓度的SDS－PAGE分离胶、5%的SDS－PAGE浓缩胶，室温放置20min使其聚合完全。常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜及相应二抗37℃孵育1h，ECL显色后，避光孵育10min，曝光显像。β－actin作为内对照。利用凝胶成像分析系统采集图像，并以灰度分析软件进行条带灰度分析。分别测定每例样品特异性目的条带及其对应的β－actin条带的灰度值。按公式:相对灰度值=目的条带的灰度值/同一标本β－actin灰度值，计算每一样品相应指标的相对灰度值，显示目的蛋白的表达水平。

1.2.5 统计学处理

采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。所有数据均用均数±标准差(±s)表示，两两比较采用LSD－t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 针刺对NF－κBp65蛋白免疫印迹表达的影响

实验结果表明，各组不同时间点都有NF－κBp65蛋白表达，模型组从ICH后6h表达量开始明显增加，蛋白表达持续增强，于2天时间点达到高峰，并且除7天时间点外各时间点与空白组比较均有显著性差异(P＜0.01);西药组蛋白表达也在2天时间点达到高峰，但各时间点与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05);针刺组在6h时表达一过性下调，随后开始增强，也在2天时间点达高峰，6h、1天和3天时间点与模型组和西药组比较均有显著性差异(P＜0.01)，见表1。

2.2 针刺对实验性大鼠ICH后脑水含量的影响

空白组大鼠无脑水肿表现。造模后各组大鼠均出现不同程度的脑水肿现象，与空白组比较有显著性差异(P＜0.01)。其中针刺组在6h时间点，脑水肿程度较模型组及西药组减轻，但差异不明显(P＞0.05)。在其余时间点与模型组比较，脑水肿程度显著减轻(P＜0.01);1天、2天和3天时间点与西药组比较，差异有统计学意义(P＜0.05);模型组大鼠术后6h出现轻度脑水肿现象，1天和2天时间点脑水含量明显增加，高峰出现在3天时间点，造模后7天仍有轻度脑水肿现象。西药组与模型组比较，1天、2天和3天时间点脑水肿程度较模型组明显减轻，差异有统计学意义(P ＜0.05)，见表2。

表1 实验性ICH大鼠灶周脑组织NF－κBp65蛋白表达灰度值相对含量的比较(±s，n=6)

表1 实验性ICH大鼠灶周脑组织NF－κBp65蛋白表达灰度值相对含量的比较(±s，n=6)

注:针刺组与模型组比较，▲P＜0.01;针刺组与西药组(茴拉西坦组)比较，●P＜0.01;模型组与空白组比较，★P＜0.01。

组别 n 6h 1天 2天 3天 7天空白组 6 0.248 ±0.034 0.248 ±0.034 0.248 ±0.034 0.248±0.034 0.248 ±0.034针刺组 30 0.220±0.056▲● 0.227±0.060▲● 0.432±0.066 0.236±0.042▲● 0.259±0.059模型组 30 0.373 ±0.070★ 0.440 ±0.076★ 0.465 ±0.058★ 0.405 ±0.074★ 0.251 ±0.079西药组 30 0.384 ±0.079 0.430 ±0.076 0.470 ±0.078 0.409 ±0.080 0.266 ±0.048

表2 各组大鼠脑水含量比较(±s，%)

表2 各组大鼠脑水含量比较(±s，%)

注:针刺组与模型组比较，▲P＜0.01;针刺组与西药组(茴拉西坦组)比较，●P＜0.05;西药组与模型组比较，#P＜0.05;模型组与空白组比较，★P＜0.01。

组别 n 6h 1天 2天 3天 7天空白组 6 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21 63.33 ±1.21模型组 30 67.83 ±1.47★ 79.00 ±1.55★ 81.67 ±2.07★ 84.17 ±1.47★ 67.17 ±1.47★西药组 30 68.33 ±1.75 76.17 ±1.72# 77.83 ±1.47# 81.00 ±1.41# 66.50 ±1.05针刺组 30 67.33±1.97 71.33±1.21▲● 73.50±1.05▲● 75.33±1.86▲● 64.50±2.17▲

2.3 实验性大鼠ICH后灶周组织NF－κBp65表达和脑水含量的相关性分析

对实验性大鼠ICH后脑组织NF－κBp65表达和脑水含量的相关性分析，得到回归方程为:y=43.6x+59.1，r=0.60，对相对系数 r采用 t检验，P ＜0.01，表明二者呈正相关，如图1所示。

图1 实验性大鼠ICH后灶周NF－κBp65表达与脑水含量的相关性分析

3 讨论

3.1 针刺对ICH大鼠脑水含量影响的探讨

大量研究证实［5］，ICH急性期炎症反应程度与血肿周围脑组织水肿及继发性脑组织损害密切相关，是ICH后引起继发性损害病理生理的重要环节。我们研究发现，在6天时间点，针刺组脑水肿程度较模型组减轻，提示针刺在ICH超早期有作用，在造模后3天时间内，针刺组脑水肿程度均较模型组明显减轻，说明头针疗法在ICH后脑水肿高峰期有明显作用;在造模后7天，针刺组脑水肿程度较模型组减轻，说明在ICH后7天头针透刺法依然发挥作用。上述实验结果提示，针刺在ICH后脑水肿防治中发挥一定作用。

3.2 针刺对实验性ICH大鼠灶周脑组织NF－κBp65表达与脑水含量相关性分析

NF－κB作为一种多向性转录调节蛋白，有关研究已证实，可高效诱导多种CK、黏附因子、趋化因子补体C3等的表达，同时对炎症级联反应中的多种酶基因的表达也具有重要的调控和转录作用［6－7］。

NF－κB作为一种重要的多靶位转录因子，可以在受损伤或存在大量炎症介质的组织细胞间激活［8］。ICH后NF－κB在调节炎症反应中起重要作用［9］，是炎症反应的重要标志物，NF－κB经典的二聚体RelA(p65)和(p50)中仅p65含有激活转录的处理区。故此，本实验选用NF－κBp65作为指标，观察ICH后血肿周围脑组织NF－κB表达的动态变化及头针透刺对其变化的影响。

通过实验研究结果表明，正常大鼠脑内 NF－κBp65蛋白轻度表达，模型组ICH后血肿周围脑组织中NF－κBp65蛋白2天达高峰，此与吴家冥等［6］研究报道结果基本一致。针刺组对NF－κBp65蛋白表达表现出显著下调作用，并且效果显著优于西药组。由此可以推断，下调脑内NF－κBp65蛋白表达可能是针刺治疗ICH获效的又一个重要机制。

此外，许多研究也表明，NF－κBp65可能是导致出血后脑水肿的一个原因［10］。我们对NF－κBp65蛋白表达与脑水含量进行了相关性分析，发现呈正相关，表明在ICH早期可能随着NF－κBp65表达的增加，激发炎症级联反应的发生，继而加重了脑水肿程度。针刺可能通过早期干预，抑制NF－κB的表达以及一系列免疫炎性反应，从而对ICH后水肿程度起到抑制作用，发挥防治ICH后继发性脑损伤的作用。

［1］ Wasserman JK，Schlichter LC.Minocycline protects the blood － brain barrier and reduces edema following intracerebral hemorrhage in the rat［J］.Exp Neuro，2007，207:227 － 237.

［2］ 王珑，邹伟，李丹，等.针刺对实验性ICH大鼠脑组织PAR－1表达的影响［J］.针灸临床杂志，2010，26(2):48 －51.

［3］ 刘芳，邹伟，张国威，等.针刺对ICH大鼠神经生长因子基因表达的影响［J］.针灸临床杂志，2007，23(5):46 －49.

［4］ Gotoh O，Sano A，Koide T，et al.Ischemic brain edema following occlusion of the middle cerebral artery in the rat［J］.Stroke，1985，16(1):101－109.

［5］ 吴君仓，群森，张持，等.ICH的病理损伤机制研究及相关治疗进展［J］.安徽医学，2009，30(4):490 －492.

［6］ 吴家冥，周向阳，储照虎，等.实验性ICH后脑组织核因子－κB表达和含水量的变化及其相关性［J］.2007，20(2):128 －130.

［7］ 邹伟，王珑，李丹，等.针刺“百会”透“曲鬓”对实验性大鼠脑出血后灶周组织PAR－1和NF－κBp65表达的影响及其相关性分析［J］.中医药学报，2011，39(3):15 －18.

［8］ 杨继文，龚树辉，张利民，等.ICH后炎症反应的研究进展［J］.脑与神经疾病杂志，2009，17(4):317 －319.

［9］ Zhao X，Zhang Y，Strong R，et al.Distinct patterns of intracerebral hemorrhage－induced alterations in NF － kappaB subunit，iNOS，and COX －2 expression［J］.Neurochem，2007，101:652 －663.

［10］ 邰贺，成媛，刘鸣明，等.与脑出血发病机制相关的细胞及细胞因子的研究进展［J］.临床误诊误治，2008，21(4):87 －89.