HPLC法测定祖师麻膏药中祖师麻甲素和紫丁香苷

2011-09-14张晓萍丁永辉李玲莉

中成药 2011年10期

张晓萍，丁永辉，李玲莉，张妍，倪琳，杨锡

(1．兰州大学药学院，甘肃兰州730000;2．甘肃省食品药品监督管理局，甘肃兰州730000;3．甘肃中医学院，甘肃兰州730000;4．甘肃省食品药品检验所，甘肃兰州730000)

祖师麻膏药收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第十八册》，为祖师麻采用传统工艺制成的黑膏药［1］。具有祛风除湿，活血止痛功能。用于风寒湿痹、瘀血痹阻经脉，症见肢体关节肿痛、畏寒肢冷、局部肿胀有硬结或瘀斑;风湿性关节炎、类风湿性关节炎见上述证候者［2］。祖师麻为瑞香科植物黄瑞香Daphne giraldii Ntcsche．或唐古特瑞香 Daphne tangutica Maxim的干燥根皮与茎皮［3］，主含香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类化学成分［4-5］，有采用HPLC法测定原药材中祖师麻甲素［6-9］、紫丁香苷［10］及其他苯丙素类成分［11］的文献报道，但祖师麻膏药原标准无定量控制指标，为了保证药品质量，本实验采用高效液相色谱法同时测定祖师麻膏药中的祖师麻甲素和紫丁香苷，方法简便，灵敏度高，结果准确，重现性较好，可以作为该制剂的质量控制依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器 Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998二极管阵列检测器(PAD);KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);德国Sartorius R200D型分析天平(十万分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(万分之一)。

1．2 试药祖师麻甲素对照品(供定量测定用，批号:0900-200001)、紫丁香苷对照品(供定量测定用，批号:111574-200201)，均购自中国药品生物制品检定所;祖师麻膏药(武威泰康制药有限公司提供，批号为 20100503、20100504、20100505)，乙腈为色谱纯;水为超纯水;其它试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验色谱柱:CAPCELL PAK MG C18(250 mm ×4．6 mm，5 μm);PAD检测器;以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)为流动相;体积流量1．0 mL/min;检测波长225 nm;柱温30℃。

2．2 对照品溶液的配制精密称取祖师麻甲素对照品8．88 mg，置100 mL量瓶中，用85%甲醇溶解并定容至刻度，备用［12］。精密称取紫丁香苷对照品5．70 mg，置100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，备用。分别精密吸取上述祖师麻甲素对照品溶液10 mL和紫丁香苷对照品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用85%甲醇定容至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2．3 供试品溶液的制备取本品，除去背衬，剪碎，混匀，取约5g，精密称定，精密加入水50 mL，称定质量，超声1 h(频率 40 Hz、功率 250 W)，放冷，再称定质量，用水补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液。滤液用0．45μm滤膜过滤，即得。

2．4 阴性对照溶液的制备按处方比例及制备工艺，配制不含祖师麻药材的阴性样品，同法制备阴性样品溶液。

2．5 方法的专属性考察按照上述色谱条件，精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪。结果:供试品中祖师麻甲素和紫丁香苷与相邻组分达到基线分离，且峰形良好，样品中其他组分对祖师麻甲素和紫丁香苷的测定无干扰，理论塔板数按紫丁香苷计不小于4 000。结果见图1。

2．6 线性关系的考察取2．2项下的混合对照品溶液(含祖师麻甲素 8．88 μg/mL，紫丁香苷 0．57 μg/mL)10．0、15．0、20．0、25．0、30．0 μL 分别进样，按上述色谱条件记录色谱图，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，祖师麻甲素和紫丁香苷对照品进样量为横坐标，进行线性回归，得回归方程:祖师麻甲素Y=2．685 8 ×106X －6．010 ×103，r=0．999 6;紫丁香苷 Y=4．187 6 ×106X －1．373 4 ×103，r=0．999 3。以上结果表明:祖师麻甲素进样量在0．088 8μg～0．266 4 μg、紫丁香苷进样量在 0．005 7 μg ～0．017 1μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

图1 祖师麻膏药高效液相色谱图Fig．1 HPLC chromatograms of Zushima Plasters

2．7 精密度试验取2．2项下的混合对照品溶液，连续进样6次，每次进样20μL，结果:祖师麻甲素的RSD为0．37%，紫丁香苷的RSD为2．21%。

2．8 重复性试验取同一个批号的祖师麻膏药(批号:20100505)，平行取样6份，按2．3项方法操作并检测。祖师麻甲素平均质量分数0．18 mg/g，RSD为0．76%;紫丁香苷平均质量分数为26．54 μg/g，RSD为2．11%，表明方法重复性较好。

2．9 稳定性试验取同一批供试品溶液(20100505)，于 0、4、8、12、16、20、24 h 按上述色谱条件分别进样20μL，按峰面积计算，祖师麻甲素的RSD值为0．80%，紫丁香苷的RSD值为1．84%，表明供试品溶液中祖师麻甲素和紫丁香苷在24 h内稳定。

2．10 回收率试验取已知量的供试品(祖师麻甲素:0．18 mg/g，紫丁香苷:26．54 μg/g)约 2．5 g，分成3组(每组3份)，置50 mL量瓶中，每组分别精密加入祖师麻甲素对照品溶液(0．088 8 mg/mL)4、5、6 mL，加入紫丁香苷对照品溶液(13．2 μg/mL)4、5、6 mL，加水适量，超声处理 60 min，取出，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，进样，测定，结果见表1～2。

表1 祖师麻甲素加样回收率试验结果(n=9)Tab．1 Results of recovery test of daphnetin(n=9)

表2 紫丁香苷加样回收率试验结果(n=9)Tab．2 Results of recovery test of syringin(n=9)

2．11 样品测定取3批供试品，同2．3项供试品溶液的制备方法处理样品，作为供试品溶液。用0．45μm微孔滤膜过滤，各取续滤液20μL，注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定，计算样品中祖师麻甲素和紫丁香苷的量，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=3)Tab．3 Determ ination results of sam ple(n=3)

3 讨论

3．1 本实验比较了不同提取溶剂(甲醇，85%甲醇，水)和不同提取方法(回流法和超声法)的提取效率，并对超声提取时间(0．5、1、1．5 h)进行了考察，结果显示:用超声法和回流法提取结果没有显著差异;3种溶剂，甲醇提取液中祖师麻甲素和紫丁香苷量均很低，水和85%甲醇提取液中紫丁香苷的量相差不大，但水提液中祖师麻甲素的量明显很高，并可排除膏药基质的干扰。因超声提取更为便捷快速，所以选择用水做溶剂超声提取，最佳超声时间为1 h。

3．2 我们用PAD检测器分别对祖师麻甲素对照品溶液和紫丁香苷对照品溶液在200 nm～400 nm进行全波长扫描，结果祖师麻甲素最大吸收波长为324 nm，紫丁香苷最大吸收波长为225 nm;因供试品中紫丁香苷量较低，为了提高检测方法的灵敏度，选择225 nm为测定波长，结果祖师麻甲素和紫丁香苷峰型较好，可满足定量要求。

3．3 我们曾采用文献报道的方法进行测定［13］，但紫丁香苷保留时间为3 min，影响测定结果的重现性，通过反复试验，确定以乙腈-0．4%磷酸(10∶90)为流动相，紫丁香苷、祖师麻甲素和各杂质峰均可达到基线分离，且保留时间适中。

3．4 本方法具有样品预处理简单，在同一色谱条件下同时测定两种成分的优点，可作为控制祖师麻膏药质量的依据。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会．中华人民共和国卫生部标准(中药)(卫生部药品标准中药成方制剂第十八册)［S］．

［2］毛著鸿，何富春，王锡银．祖师麻膏药质量标准研究［J］．甘肃医药，2010，29(5):562-564．

［3］甘肃省食品药品监督管理局．甘肃省中药材标准［S］．甘肃:甘肃文化出版社，2009．

［4］康阿龙，汤迎爽，张苏蘅，等．HPLC测定祖师麻药材及不同炮制品中祖师麻甲素［J］．中国实验方剂学杂志，2010，16(16):39-41．

［5］李书慧，吴立军，殷红英．祖师麻化学和药理活性研究进展［J］．中国中药杂志，2002，27(6):401-403．

［6］蒋以号，杨武亮，陈海芳，等．HPLC测定不同基源及不同产地祖师麻中祖师麻甲素［J］．中草药，2008，39(7):1096-1098．

［7］刘亚蓉．唐古特瑞香中祖师麻甲素的HPLC法含量测定［J］．陕西中医，2009，30(1):85-87．

［8］刘冰，吕曙华，吴贵华，等．高效液相色谱法测定祖师麻药材中祖师麻甲素［J］．中草药，2010，41(5):832-834．

［9］邸立杰，王晓云．祖师麻药材鉴别及祖师麻甲素含量的测定［J］．中国药事，2008，22(1):43-45．

［10］齐香君，李楠，单燕凤，等．HPLC测定祖师麻中紫丁香苷［J］．中草药，2005，36(8):1243-1244．