王守岩 高 原 关洪全 王 哲 马贤德井 欢 王 莹 赵金茹 柴继严 王 健

辽宁中医药大学（辽宁沈阳 110847）

眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α表达的影响*

王守岩 高 原 关洪全 王 哲 马贤德井 欢 王 莹 赵金茹 柴继严 王 健△

辽宁中医药大学（辽宁沈阳 110847）

目的 通过观察不同时限缺血再灌注损伤后脑组织肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，探讨TNF-α对脑缺血再灌注损伤的作用机制，并观察眼针对其干预作用。方法SD大鼠随机分为正常对照组、假手术组、模型组、眼针组；采用改良线栓法复制大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，选取眼穴肝区、肾区、上焦区、下焦区，平刺，进针3mm，留针20min；分别于脑缺血再灌注后3、24、72h处死动物并取材；应用免疫组织化学染色法和蛋白质印迹法（Western blot）检测脑组织中TNF-α蛋白表达。结果 眼针组TNF-α在脑组织再灌注后3、24、72h均较模型组明显降低，有显著差异。结论 眼针疗法可以降低脑缺血再灌注模型大鼠脑组织TNF-α的表达，进而抑制由脑缺血再灌注诱导的炎症反应，发挥脑保护的作用。

眼针 缺血再灌注 肿瘤坏死因子-α

眼针疗法是辽宁中医药大学附属医院彭静山老先生发明的一种针刺疗法，临床应用多年，对缺血性脑中风等疾病具有很好的疗效，国内外同行学者对其评价很高，但其机制尚未阐明。脑缺血再灌注后脑内肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达增加［1］，具有神经保护和促进神经修复等作用。但TNF-α在脑缺血再灌注中发生损伤的作用机制尚不完全清楚。本研究通过不同时限缺

血再灌注损伤后脑组织匀浆的TNF-α蛋白表达，探讨TNF-α的损伤作用机制，并观察眼针对其干预作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 健康SD大鼠96只，雌雄不拘，体质量（280±20）g，由北京维通利华实验动物中心提供。适应性喂养1周，自由饮水、摄取标准颗粒饲料，室内温度22℃，相对湿度45%。将大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、眼针组4组（根据缺血再灌注损伤时间分设3、24、72h亚组，共计3个观察时间点），每亚组8只。

1.2 试剂 亲和纯化兔抗鼠TNF-α多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒及DAB染色试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 模型制备与评价 模型组及眼针组采用改良的线栓法复制大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，模型制作按照文献［2］记载方法进行。模型成功标准：大鼠于缺血2h后进行再灌注，再灌注后进行神经功能缺损评分，参照Longa 5分制评分标准［3］：0分为无症状；1分为不能完全伸展对侧前爪；2分为向对侧转圈；3分为向对侧倾倒；4分为不能自发行走，意识丧失。评分为1～3分者纳入实验组，未达标准者排除。假手术组术式同模型、眼针组，区别在于钓鱼线插入深度为0.5～1cm，其他同手术组。正常组未处理。

1.4 眼针取穴及刺法 眼针组：用31号13mm毫针，于大鼠眶周2mm处针刺，定位参照人体取穴方法［4］，取肝区、上焦区、下焦区、肾区针刺。手法：平刺，进针3mm。留针10min时用刮柄进行刮针1次，刮针5下。治疗时间：3h眼针刺组于脑缺血再灌注即刻及其取材前30min，分别进行眼针治疗；24h及72h眼针组于脑缺血再灌注即刻及其取材前30min分别进行眼针治疗，此外，每12小时针刺1次。

图1 大鼠眼针取穴示意图

1.5 标本采集与检测 （1）脑组织TNF-α蛋白表达（免疫组化SABC法）检测：分别于缺血再灌注损伤3、24、72h给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸暴露心脏，将灌注针头从心尖部插入升主动脉，待右心耳膨起后剪开右心耳，依次迅速灌注0.9%生理盐水200mL，4%多聚甲醛200mL，迅速取脑，在视交叉平面后约5～10mm处将脑冠状切面切开，留取中间部分，置于4%多聚甲醛固定液中固定，常规脱水、石蜡包埋。将包埋的蜡块作5μm切片，免疫组化按试剂盒操作。TNF-α以细胞浆或细胞核出现清晰棕褐色颗粒为阳性。使用BI2000医学图象分析系统对采集的图像测定阳性反应物的灰度，每例动物随机取3～4张切片，且各组所选部位相同。（2）脑组织TNF-α蛋白表达（Western blot法）检测：分别于缺血再灌注损伤3、24、72h给予大鼠10%水合氯醛腹腔注射麻醉后断头取出脑组织，去掉小脑，沿两侧大脑半球连接处将大脑半球切开，取出病变侧顶叶部分脑皮质，按脑组织净重：裂解液=1：10的比例，加入相应体积的裂解液，pH为7.5，将样品剪碎后匀浆、离心、上清即为总蛋白。兔抗鼠 TNF-α 一抗 （1∶500）；O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate显色；扫描仪扫描NC膜，分析结果。

1.6 统计学处理 采用SPSS 10.0统计软件分析，实验数据均采用（±s）表示，采用方差分析进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经功能缺损程度评分 见表1。模型组和眼针组大鼠均出现不同程度的神经功能障碍，如提尾时左侧前肢不能伸直，行走向对侧旋转或倾倒等；假手术组大鼠无神经功能障碍表现。与模型组比较，眼针组再灌注损伤3、24、72h后神经功能缺损程度评分均有差异（P＜0.01）。

表1 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点神经缺损程度评分比较（分，±s）

表1 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点神经缺损程度评分比较（分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。 下同。

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2.2 眼针对大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α蛋白表达的影响

2.2.1 免疫组化方法检测结果 见图2、表2。模型组脑组织TNF-α表达明显强于正常组和假手术组。正常组和假手术组大鼠各时点仅有少量TNF-α阳性染色，模型组TNF-α的阳性表达在3h开始升高，24h较为明显，72h达高峰。与模型组比较，眼针组TNF-α的阳性表达在3h开始减少，24h表达明显减少，72h表达减少最为显著。眼针组TNF-α表达明显低于模型组，均有显著差异（P＜0.01）。

图2 各组脑皮层TNF-α蛋白表达切片图（SABC 法，×400，箭头示 TNF-α 蛋白表达）

表2 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α蛋白表达比较（灰度值，±s）

表2 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α蛋白表达比较（灰度值，±s）

与正常组比较，△P＜0.05。下同。

组 别 n 3h 24h 72h正常组 8 114.86±10.50 114.86±10.50 114.86±10.50假手术组 8 119.71±8.92 121.10±8.92 122.08±8.92模型组 8 153.42±12.17△ 158.46±13.49△ 161.85±13.21△眼针组 8 137.73±12.08** 138.76±12.08** 138.96±12.08**

2.2.2 Western blot方法检测结果 见图3、表3。以β-actin为内参，表达结果为：1泳道为正常对照组，2泳道为假手术3h组，3泳道为模型3h组，4泳道为眼针3h组，5泳道为假手术24h组，6泳道为模型24h组，7泳道为眼针24h组，8泳道为假手术72h组，9泳道为模型72h组，10泳道为眼针72h组。模型组TNF-α蛋白表达强度明显强于对照组和假手术组，眼针组表达明显低于模型组，均有显著差异（P＜0.05）。

图3 大脑皮层TNF-α蛋白表达电泳图

表3 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α蛋白表达比较（灰度值，±s）

表3 各组大鼠脑缺血再灌注损伤不同时间点脑组织TNF-α蛋白表达比较（灰度值，±s）

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3 讨 论

TNF是一类能直接导致某些肿瘤细胞坏死的细胞因子，人体内的TNF主要是TNF-α。TNF-α在脑缺血性疾病中具有双重性，适当的TNF-α可调节机体的免疫功能，增强对入侵病原体的抵抗力，对维持机体内稳态及抵制各种致病因子具有重要意义。而过量的TNF-α则可导致多种病理改变。国外研究证明，炎性细胞因子TNF-α仅作为缺血性脑损伤所诱发的初始调节因子，其表达上调与脑缺血再灌注损伤密切相关，参与了脑缺血再灌注损伤病理过程［5］。

本实验结果显示，正常组和假手术组大鼠脑组织仅见少量TNF-α表达，说明TNF-α在正常脑组织中低含量存在，可能与神经细胞的正常维护有关。模型组大鼠脑组织TNF-α蛋白表达在缺血再灌注3h开始升高，随着缺血再灌注时间的延长，24h明显升高，72h升高达高峰，说明脑缺血再灌注后72h内，TNF-α的表达随时间的延长而逐渐增多，其原因可能与脑缺血缺氧等刺激，以及胶质细胞坏死溢出有关。给予眼针治疗后，大鼠脑组织TNF-α蛋白在各时相均明显下降，说明眼针在脑组织缺血再灌注中能够抑制TNF-α的表达，减轻对脑组织的损伤。

眼针是在眼眶周围针刺以治疗全身疾病的一种微针技术，它是针灸施术的一种特殊针法。脑为奇恒之府，脑由髓汇集而成，故名“髓海”，脑是精髓和神明高度汇集之处，有元神之府。眼与脑密切相连。《证治准绳》载“目形类丸，内有大络六，谓心、肺、脾、肝、肾，命门各主其一；中络八，谓胆、胃、大小肠，三焦、膀胱各主其一；外有旁支细络莫知其数，皆悬贯于脑”［6］。说明眼通过经络与脑密切相连。“五脏六腑之精气，皆上注于目，而为之晴。精之窠为眼，其窠气之精为白眼，肌肉之精为约束。裹撷筋骨血气之精，而与脉并为系，上属于脑，后出于项中，故邪入于项，因逢其身之虚，其入深，则随目系以入脑。”［7］“八廓应乎八卦，脉络经纬于脑，贯通脏腑，以达血气，往来以滋于目。”说明眼与脑通过经络密切相连，生理上相互协调，病理上也是病邪传变的途径。脑缺血再灌注损伤属中医“中风”范畴，是由脏腑功能失调，气血逆乱，脑脉闭阻而成，属本虚标实之证。本实验取眼针肝区、肾区补益肝肾以充髓海，治其本，上焦区、下焦区活血化瘀以通经络，开窍醒神以治其标。本研究表明眼针通过直接抑制缺血性脑损伤大鼠脑组织TNF-α蛋白的表达来实现对脑细胞损伤的保护可能是其作用机制之一。

［1］Wang Y，Kawamura N，Schmelzer JD，et al.Decreased peripheral nerve damage after ischemia-reperfusion injury in mice lacking TNF-α ［J］.Neurol Sci， 2008，267（1–2）：107-111.

［2］马贤德，孙宏伟，等.线栓法制备大鼠脑缺血再灌注模型的方法研究［J］.中华中医药学刊，2009，27（6）：1200-1201.

［3］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［4］彭静山.眼针疗法［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，1990：11.

［5］Sairanen T，Carpen D，Karjalainen-lindsberg ML，et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor-a production during human ischemic stroke［J］.Stroke，2001，32（8）：1750-1758.

［6］明·王肯堂.证治准绳［M］.北京：中国中医药出版社，1997：226.

［7］程士德.内经讲义·灵枢·大惑论［M］.上海：上海科技出版社，1984：56.

Effect of Eye Acupuncture Therapy on Brain TNF-α Expression at Different Time Points in Rats with Cerebral Ischemia Reperfusion

WANG Shou-yan,GAO Yuan,GUAN Hong-quan,et al
Liaoning University of Traditional Chinese Medcine（Shenyang 110847,Liaoning）

Objective:To investigate TNF-α expression at different time points in the brain of rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,in order to discuss the mechanism and observe the intervention effects of eyeacupuncture therapy.Methods:Healthy SD rats,male and female,were randomly divided into 4 groups:the normal group,the sham-operated control group,the model group and the eye-acupuncture group.The sham-operated control group,the model group and the eye-acupuncture group were divided into the 3h group,the 24h group and the 72h group.The rat model of cerebral ischemia-reperfusion was established by suture method.Eye acupoint liver area,kidney area,upper jiao area and lower jiao area were selected and acupunctured horizontally,inserting needle in 3mm deep,retaining needle for 20 minutes.All animals were executed respectively at 3h,24h,72h after reperfusion and draw materials.The method of immunohistochemistry and Western blot technology was taken to detect the changes of brain TNF-α expression in rats after the eye-acupuncture therapy.Results:Compared with the model group,TNF-α expressions in the brain of rats of the eye-acupuncture group were decreased obviously at 3h,24h,72h after reperfusion.These differences were significant.Conclusion:The eye-acupuncture therapy can regulate down brain TNF-α expressions in rats with cerebral ischemia-reperfusion injury,suppress inflammatory response induced by cerebral ischemia-reperfusion and play a role in protecting brain.

Eye acupuncture;Ischemia-reperfusion;Tumor necrosis factor-α

R245.3

A

1004-745X（2011）12-1939-03

国家重点基础研究发展计划项目（2007CB512702）

△通信作者

2011-07-24）