万春和，黄 瑜，程龙飞, 傅光华, 施少华, 陈红梅

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福州 350013)

圆环病毒科（Circoviridae）包括2个属：圆圈病毒属（Gyrovirus）和圆环病毒属（Circovirus）。圆圈病毒属只有鸡贫血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）一个成员；而圆环病毒属目前有包括猪圆环病毒（Porcine circoviruses, PCV1 、PCV2）I型和II 型、鹦鹉喙羽病毒（Psittacine beak and feather disease virus, BFDV）[1]、鸽圆环病毒（Pigeon circovirus, PiCV）[2]、鹅圆环病毒（Goose circovirus,GoCV）[3]、鸭圆环病毒（Duck circovirus, DuCV）[4]、金丝雀圆环病毒(Canary circovirus,CaCV)[5]、渡鸦圆环病毒(Raven circovirus, RaCV)[6]、八哥圆环病毒（Starling circovirus，StCV）[7]、雀圆环病毒(Finch circovirus, FiCV)、鸥圆环病毒(Gull circovirus,GuCV)[8]和天鹅圆环病毒(Mute swans (Cygnus olor)circovirus, SwCV)[9]等。

鸽圆环病毒(GoCV)最早于1993年在美国报道[10]，此后在加拿大[11]、澳大利亚[12]、德国[2]、英国[3]、法国[13]、比利时[14]、意大利[15]和美国[16]均发现有感染报道。余旭平等[17,18]最早在中国浙江省检测到鸽圆环病毒感染，并对浙江省鸽圆环病毒的基因组结构进行分析。本文根据GenBank登录已发表的PiCV序列设计引物，对来自福建省某信鸽养殖厂送检病料进行PiCV检测，通过反向PCR技术获得全长基因序列，并进行生物信息学分析。

1 材料与方法

1.1 主要试剂蛋白酶K（Proteinase K）和十二烷基硫酸钠（SDS） 购自Sigma公司；DreamTaq Green PCR Master Mix购自Fermentas公司；DNA Marker（DL2000）和pMD18-T载体均购自宝生物工程（大连）有限公司；胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒均购自Omega；大肠杆菌DH5α感受态细胞自制。

1.2 病料处理及核酸提取参考文献[19]，实验病料为来自福建省某信鸽场，采集送检信鸽肝脏和脾脏。将组织以无菌PBS（pH 7.4）1: 5按常规方法匀浆后，反复冻融3次。提取鸽圆环病毒基因组DNA步骤：取1 mL组织匀浆液于室温10 000×g离心5 min，取540μL上清，加入60μL 10% SDS于37℃水浴作用30 min，加入15μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀后于56℃水浴作用2 h，间或摇匀。取出后分别置于95℃ 和-20℃各5 min后，加入等体积Tris饱和酚，混匀后静置15 min后，4℃ 12 000×g离心10 min。取离心上清再次加入等体积Tris饱和酚，重复离心。取离心上清加入1/10（上清体积）pH 5.2 醋酸钠溶液和1/10（上清体积）异丙醇，混匀后置于-20℃过夜后，4℃ 12 000×g离心10 min，弃上清，挥发片刻后加入30 μL灭菌去离子水重悬，-20℃备用。

1.3 鸽圆环病毒基因的PCR扩增参考文献[16]设计引物，扩增的目的片段大小约为759 nt。引物序列 为 P1F：5'-GATGACTTCTACGGCTGGCTGCC-3'、P1R: 5'-ACGGCAAACCAGTCGGCAGCAACC-3'。PCR采用50μL体系：DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL、上下游引物（引物浓度为20 mmol/L）各 1μL、DNA 模板 1μL、加双蒸水至终体积为50μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min，随后进行94 ℃变性50 s、53 ℃退火35 s、72℃延伸1 min循环，35个循环后，72℃延伸10 min。反应结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。将PCR产物目的片段经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用双酶切和PCR方法鉴定重组质粒，随机选取3个阳性重组质粒送由上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.4 病毒全基因组的测定根据1.3中的测序结果，参考GenBank中鸽圆环病毒登录的序列设计一对反向引物（invers-primer）用于扩增病毒基因组余下的基因片段P2F：5'-TCACTTCACATTCATAATACAT-3'、P2R: 5'-TGCTGGTCACTATTATCACGC-3'。扩增片段大小约1560 nt，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应条件为：94℃预变性5 min，随后进行94℃变性 50 s、52℃退火35 s、72℃延伸 100 s，35个循环后，72℃延伸10 min。反应结束后，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。将PCR产物目的片段经胶回收试剂盒纯化后与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用双酶切和PCR方法鉴定重组质粒，随机选取3个阳性重组质粒送上海生工生物工程有限公司进行序列测定。

1.5 全基因序列分析将测序结果与GenBank中登录的序列进行分析，用Lasergene v 7.1 DNAStar软件进行序列整理和校对，将拼接后的核苷酸序列，分别与GenBank中登录的鸽圆环病毒（GenBank登录号见表1）进行同源性比较，用MEGA4.1绘制遗传进化树[20]，以鹅圆环病毒株（GenBank登录号GU320569）作为外支（outgroup），用Bootstrap对进化树的可靠性进行评价，重复1000次。

2 结果

2.1 测序结果应用Lasergene v 7.1 DNAStar软件分析序列测定结果，并进行序列拼接后获得PiCV-fj1株病毒基因组全长2037 nt（GenBank登录号JN183455）。分析可得，该株病毒ORF-V1(41～994nt) 编码复制相关结构蛋白（the replicated-associated protein，Rep），ORF-C1（1987～1166nt）编码核衣壳蛋白（the putative capsid protein，Cap）。在2个主要编码区外，还存在有2个可能与病毒复制有关的基因间区（intergenic region）：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′断之间的区域，由2个反向的重复序列构成了一个发夹结构(见图1)，其顶部有1个保守的9碱基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在茎环结构的下游还存在有反向重复序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG)，N表示碱基不完全互补；其3′端基因间区长度为171nt。

图1 鸽圆环病毒福建株5′基因间区结构图Fig.1 The 5'intergenic region of Pigeon circovirus fj1 strain

2.3 核苷酸同源性比较应用Lasergene v7.1DNAStar软件（By Clustal W Method Sequence Distance），将拼接后核苷酸序列，与GenBank登录的所有的鸽圆环病毒全基因序列进行同源性比较，结果见表1。与比利时分离株Bel936同源性最高，达93.8%；与澳大利亚分离株Dove同源性最低，仅84.5%。

2.4 遗传进化分析以GoCV作为外支，运用MEGA4.1绘制鸽圆环病毒福建株fj1和GenBank登录的所有鸽圆环病毒遗传进化树，并用Bootstrap评价进化树的可靠性，重复1000次，结果见图2。可见，鸽圆环病毒在遗传进化上分为2个明显的分支，以编码核衣壳蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密码子“ATA”和“ATG”的差异（见表1）分为ATA分支和ATG分支（fj1§为鸽圆环病毒福建株）。

3 讨论

3.1 到目前为止，圆环病毒属除PCV（PCV1和PCV2）可以在PK-15细胞中繁殖外，其余成员均尚未能细胞培养，大大限制了对其进行深入研究。圆环病毒为无囊膜、二十面体对称的动物病毒，其复制需要依赖于旺盛的宿主细胞活力，增殖速度快的淋巴细胞是圆环病毒侵染的主要宿主。因此，圆环病毒感染往往导致机体免疫混乱、免疫力下降，进而引起多种条件性病原的二次感染，鸽感染圆环病毒后可表现为昏睡、食欲降低、体重减轻等症状[10-16,18,21]。本研究中福建某地送检的信鸽检测到PiCV感染，由于PiCV既可通过粪便等污染物水平传播，又可经鸽胚垂直传播[22]，提示我们在信鸽引育种环节应注意相关感染的监测。

3.2 本实验株fj1基因组全长为2037 nt，与比利时分离株Bel936同源性最高，达93.8%；与澳大利亚分离株Dove同源性最低，仅84.5%，和余旭平报道的稍有差异。经分析fj1基因组编码2个主要ORF(见表1)：复制相关rep蛋白编码的ORFV1(41～994nt)， 外 壳 蛋 白 cap 编 码 的 ORF-C1(1987～1166 nt)。在病毒的两个主要编码区外还存在有2个可能与病毒复制、增殖相关的基因间区：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′端之间的区域，fj1株长度为90 nt，其他鸽圆环病毒5′端间区长短略有差异，主要集中在90～101 nt之间（数据未给出），由2个反向的重复序列构成了一个发夹结构，

其顶部有1个保守的9碱基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在茎环结构的下游还存在有反向重复序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG) ,一般认为该病毒是通过滚环模式进行核酸复制，反向PCR扩增剩余病毒基因组片段也正是基于上述特点。其ORF-C1编码的Cap蛋白起始密码子有2类，除常见的“ATG”外还有“ATA”，这和其3′端基因间区长度为171 nt或170 nt有关：3′端基因间区长度为171nt，其ORF-C1起始密码子均为“ATG”，而3′端基因间区长度为170 nt，其ORF-C1起始密码子均为ATA（见表1）。

表1 fj1株与其它鸽圆环病毒全基因核苷酸同源性分析Table1 Homology identity analysis all of the nucleotide in the genus Pigeon circovirus

图2 鸽圆环病毒遗传进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Pigeon circoviruses

3.3 对GenBank中登录的所有鸽圆环病毒全基因序列进行遗传进化分析（图2），可见鸽圆环病毒在遗传进化上分为两个明显的分支。结果分析表明，两个独立遗传进化分支与编码核衣壳蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密码子碱基（ATA和ATG）（见表1）相一致，其中Cap蛋白起始密码子为“ATA”为一个分支，而Cap蛋白起始密码子为“ATG”均处在另外一个分支。本实验株和我国浙江分离株均处在“ATG”分支，但分处不同的亚群，提示我国PiCV的感染和进化可能有不同的进化来源或独立进化的时间较长，相关遗传进化与编码Cap蛋白起始密码子的关联还需要更多更深入的研究。

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