徐英杰，尹羽薇，董清平

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001;3.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040)

骨关节炎(osteoarthritis OA)是一种以关节软骨退行性变和继发性骨质增生为主要病理特征的慢性骨关节疾病，近年来其发病率有增高的趋势，具体病变主要涉及关节滑膜、关节周围组织，关节软骨与关节软骨下骨［1］，是一种严重影响中老年人日常活动的常见骨科疾病。通过中药超微粉治疗兔骨性关节炎模型，并通过研究关节软骨中MMP－1及TIMP－1 mRNA表达的含量的变化，旨在探讨他们在骨性关节炎中的作用，为骨性关节炎的诊治提供科学的依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

健康成年雄性新西兰白兔40只，普通级，体重(2.5±0.1)kg。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供［SCXK黑2006－007］，将40只新西兰白兔随机分成模型组、通络骨质宁膏组、传统中药组、中药超微粉组4组，每组10只，右膝造模，并随机选取10只左膝作为空白对照组。

1.2 造模方法

模型组、通络骨质宁膏组、传统中药组、中药超微粉组采用Hulth［2］造模方法并加以改进制成兔骨性关节炎模型。取兔膝关节内侧入路，切断内侧副韧带，摘除内侧半月板，切断前交叉韧带。术后连续3天青霉素20万U肌肉注射，1周后开始每天强迫兔活动1h，连续4周。

1.3 中药物配制

中药超微粉方由元胡、川芎、骨碎补、淫羊藿、续断、当归、威灵仙、冰片组成，黑龙江中医药大学实验中心制备。方法为取100倍处方量的醇提部分药材，加50%乙醇浸泡1h，50%乙醇加热回流2次(10倍，1.5h;8倍，1.0h);分别过滤，得醇提液，经旋转蒸发仪回收乙醇后水浴浓缩至干燥，粉碎备用，得细粉A。冰片缓慢加入50%乙醇溶解制成饱和溶液，得溶液B。将A粉与B液混合制成约每毫升含1g生药的药液C。取100倍处方量的粉碎部分药材，用中药粉碎机粉碎后过100目筛，得细粉D。将药液C与细粉D充分混合得中药超微粉贴剂。

通络骨质宁膏(贵州同济堂制药有限公司，批准文号:国药准字Z20025964)。

1.4 仪器与试剂

PCR扩增仪(美国Perkin Elmer公司);随机寡核有酸引物oligo(dt)，逆转录酶RTase及Trizol液(GIBCO公司);Tap酶及dNTP(Promega公司);RNA酶抑制剂RNAsin(华美生物制品公司);寡核有酸引物(TaKaRa公司合成)。

2 治疗方法

模型组，造模成功后，外敷医用橡皮膏常规饲养6周。通络骨质宁膏组，造模成功后，外敷通络骨质宁膏常规饲养6周。传统中药组，造模成功后，外敷传统粉碎的中药常规饲养6周。中药超微粉组，造模成功后，外敷制备的中药超微粉中药，常规饲养6周。每日1次，每次12h，共治疗6周。

3 实验方法及结果

3.1 关节软骨中MMP－1及TIMP－1 mRNA表达的含量的测定

取兔膝关节退变区软骨及关节腔内侧滑膜去粗标本，迅速置于无菌的研钵中，迅速研磨，待其研成粉末状后，将粉末转入离心管，以1ml Trizol试剂加入该管，剧烈摇晃震荡2min后，室温静置5min。加入氯仿200ul，剧烈摇晃振荡 1min，静置 5min后 4℃ 离心(12 000r/min)15min。离心后管中液体分为3层:上层为无色透明的水相，RNA即留存于此相中。蛋白质保留于下层的酚－氯仿相中。DNA保留于上下两层间的中间层。将上层水相转移至另一离心管中，加入0.5ml异丙醇，室温静置10min后，4℃离心(12 000r/min)10min。弃去离心后的上清液，用75%乙醇1ml将RNA沉淀洗涤，20℃静置15min，继之以4℃离心(7 500r/min)5min。弃上清，以无菌DEPC水200ul再溶解RNA沉淀，振荡混匀后65℃加热15min。将提取出的RNA备用或于－20℃保存。600℃加热RNA样品15min，后冰浴 10min。加入 10 × buffer(DNaseI)10ul，4ul(DnseI)，1ul inhibitor(40U/ul)，37℃ 水浴 30min。加入4ul DNaseI，37℃水浴30min。加入800ul Trizol后混匀，室温下静置5min。加入200ul氯仿，混匀，室温下静置5min。4℃离心12 000r/min，15min。将上清转入另一只EP管中，加入500ul的100%冰乙醇，摇匀。－20℃ 冰箱中静置 30min。4℃ 离心 12 000r/min，10min弃上清。加入500ul的75%乙醇(DEPC水配制)，混匀，室温下静置10min。4℃ 7 500r/min离心5min，弃上清。将RNA沉淀于真空状态下45℃干燥5min。DEPC水50ul溶解RNA沉淀，振荡，离心。室温下静置10min。

表1 基因的正向引物与反向引物的扩增位置、扩增长度、退火温度

3.2 统计学处理

3.3 结果 见表2、图1。

图1 MMP－1与TIMP－1电泳图

表2 治疗4周后各组标本中MMP－1 mRNA与TIMP－1 mRNA表达量(s)

表2 治疗4周后各组标本中MMP－1 mRNA与TIMP－1 mRNA表达量(s)

注:与模型组相比，*P＜0.01，与传统中药组及通络骨质宁膏比较，#P＜0.05。

空白对照组 模型组 传统中药组 通络骨质宁膏组 中药超微粉组MMP －1 0.297 ±0.062 0.819 ±0.109 0.594 ±0.061* 0.601 ±0.061* 0.462 ±0.062*#TIMP －1 0.307 ±0.048 0.156 ±0.055 0.363 ±0.042* 0.354 ±0.052* 0.432 ±0.048*#

结果显示，正常组膝关节关节软骨中MMP－1 mRNA表达量最低，模型组膝关节关节软骨中MMP－1 mRNA的表达量最高，TIMP－1 mRNA的表达量较低;正常组膝关节关节软骨中TIMP－1 mRNA的表达量在各组中最低，传统中药组、通络骨质宁膏组中药超微粉组在治疗后关节软骨中MMP－1 mRNA与模型组比较均有所降低(P＜0.01)，其中中药超微粉组与传统中药组和通络骨质宁膏组相比有差异(P＜0.05)。中药超微粉组TIMP－1 mRNA的表达含量与传统中药组、通络骨质宁膏组相比有差异(P＜0.05)，与模型组相比有显著性差异(P＜0.01)。

4 讨论

经皮给药系统(transdermal drug delivery systems，transdermal therapeutic systems，简称 TDDS，TTS)系指经皮肤敷贴方式用药，药物由皮肤吸收进入局部，实现治疗疾病的一类制剂。在经皮给药系统中，中药的经皮给药系统发展历史悠久，经过多年的传承与发扬，逐步形成完整的体系。所谓中药经皮给药是指在中医药理论的指导下，将中药单方或中药复方经过合理的提取、分离、纯化等工艺所得到的有效部位或有效成分或其提取物等与适宜的辅料或基质制成的通过皮肤表面给药，使中药以恒定速度(或接近恒定速度)通过皮肤各层，进入机体产生局部或全身治疗作用。

本组方中以骨碎补为君药，活血续伤，补肾强骨，《开宝本草》谓其“主破血止血，补伤折”。淫羊藿补肾助阳，强筋壮骨，祛湿除湿，《日华子本草》言其主治“一切冷风劳气，筋骨挛急，四肢不仁，补腰膝”;续断补肾强筋，疗伤续折，《本草汇言》曰:“续断，补续血脉之药也。大抵所断之血脉非此不续;所伤之筋骨非此不养;所滞之关节非此不利。”二者共为臣药，以助骨碎补补肾续伤之力。元胡“能行血中气滞，气中血滞，故专治一身上下诸痛”(《本草纲目》);川芎活血行气，祛风止痛;当归补血活血，兼能散寒止痛;威灵仙祛风通络;冰片开窍通络，“能透骨热”，“亦能生肌止痛”(《医林纂要》)，以上共为佐药。诸药合用，共奏补肾通络，续筋强骨，祛风活血之功，起到镇痛、抗炎和消除瘀血肿胀的作用，阻断骨性关节炎的疾病发展过程。

从本研究的结果可以观察到，模型组关节软骨中MMP－1 mRNA表达含量较正常组明显升高，提示骨性关节炎骨节软骨中MMP－1 mRNA表达量增高，TIMP－1 mRNA的表达量含量低，也许是骨性关节炎发病过程中受多种其他因素调控，从而导致TIMP－1的含量下降，致使MMP－1与TIMP－1的比例失调，最终导致关节软骨损伤。各治疗动物组经过治疗后关节软骨中MMP－1 mRNA表达含量较模型组均有不同程度的降低，说明各组治疗药物治疗过程中都对关节软骨退变的干预起到了一定的作用，其中，中药超微粉组MMP－1 mRNA、TIMP－1 mRNA表达量与其他各组比较有差异，表明了本药物对干预关节软骨退变有着良好的效果。通过本研究可以预想，将调节关节软骨中MMP－1与TIMP－1比例关系作为治疗骨性关节炎的途径，通过干预MMP－1的上游传导通路，抑制其合成，同时通过其他方式促使TIMP－1合成，最终达到预防和治疗膝关节骨性关节炎作用。

［1］吴迪，崔明，陈云霞，等.独活寄生汤加减治疗膝关节骨性关节炎临床研究［J］.中医药学报，2011，39(2):114 －115.

［2］Hulth Jn，Barrach HJ，Chichester CO.Articular collagen degradation in the Hulth － Telhag model of osteoarthritis［J］.Osteoarthr Cartil，1999，7(6):539－547.