魏二虹 张文举 刘东军 于 磊 石国庆

棉籽饼粕富含蛋白质，是很好的动物饲料蛋白资源。但因其含有对动物有毒的游离棉酚，使其利用价值受到极大限制。为此，国内外有关研究人员对棉籽饼粕的脱毒方法及途径进行了广泛而深入的研究，取得了许多研究成果，如物理法、化学法[1-5]以及微生物发酵法等。微生物发酵法是20世纪80年代后期在中国首先发展起来的一种棉籽饼粕脱毒途径。该方法是将特定微生物接种到棉籽饼粕培养基中，在一定的条件下，利用微生物在饲料原料中的生长繁殖和新陈代谢，棉酚被分解利用或与蛋白质氨基酸结合形成结合棉酚，从而达到脱毒的目的[6-12]。前人对微生物固体发酵棉籽饼粕脱毒的研究主要集中在脱毒菌种的优化筛选[6-7,12-15]、发酵底物组成及发酵参数的优化[8-11]、发酵前后棉籽饼粕养分含量及消化利用率的变化[16-19]等方面，但对棉籽饼粕微生物固态发酵脱毒的详细机理的研究却很少[20]。本研究主要利用浙江大学选育的对棉酚具有较强降解力的热带假丝酵母菌ZD-3(Candida tropicalis)、酿酒酵母菌ZD-5(Saccharomyces cerevisiae)和黑曲霉ZD-8(Aspergillus niger)对棉籽饼进行复合菌种发酵，然后通过测定发酵底物中总棉酚（Total Gossypol，TG)、游离棉酚(Free Gossypol，FG)、结合棉酚(Bound Gossypol，BG)含量的变化，来研究复合发酵对棉籽饼混合底物中棉酚含量的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验底物

棉籽饼由新疆石河子产，粉碎，过60目筛。经测定可知样品中TG含量7 062.7mg/kg，FG含量921.7mg/kg、BG含量6 141.0mg/kg，粗蛋白含量39.20%。

棉籽饼混合底物：将上述棉籽饼与玉米粉、麦麸按7：2：1的比例混合均匀成基础底物，复合发酵时再按基础底物与蒸馏水1：0.9的比例加入蒸馏水，在0.056 MPa条件下，112.6℃蒸汽灭菌20 min。

1.1.2 菌种和培养基

1.1.2.1 菌种

热带假丝酵母菌ZD-3由浙江大学饲料科学研究所选育提供；酿酒酵母菌ZD-5、黑曲霉ZD-8由石河子大学动物营养教研组保藏。

1.1.2.2 麦芽汁培养基

大麦芽100 g粉碎，放入1 000 ml大烧杯中，加蒸馏水 400～500 ml，至烘箱中 60 ℃恒温 4～5 h，然后用8层纱布过滤，滤液一般较混浊。将一枚蛋清量加蒸馏水20 ml，搅拌至有大量泡沫，倒入混浊滤液中，煮沸，维持5 min，用8层纱布过滤，得澄清麦芽汁，用手持糖量折光仪测定糖度，然后稀释到5oBé，分装于几个三角瓶中，每个三角瓶20 ml，112.6℃灭菌30 min，保存于4℃冰箱中备用。

1.1.2.3 麦芽汁斜面培养基

5oBé麦芽汁，加入琼脂2.0%，在0.056 MPa条件下，112.6℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1 灭菌组的制备

复合发酵时按基础底物与蒸馏水1：0.9的比例加入蒸馏水，在0.056MPa条件下，112.6℃蒸汽灭菌20min。

1.2.2 菌种制备

1.2.2.1 ZD-3液体菌种

将选育的热带假丝酵母接入麦芽汁斜面培养基，30℃培养72 h，挑取一环菌苔接入5 ml麦芽汁中，在试管中30℃、150 r/min摇动培养24 h（一级菌种），取1.0 ml一级菌种接入20 ml麦芽汁，在100 ml三角瓶中30℃、150 r/min摇动培养20 h（二级菌种）。

1.2.2.2 ZD-3固体菌种

取5 ml ZD-3二级菌种接入上述100 g棉籽饼粕底物中，在500 ml三角瓶中30℃恒温静止培养48 h，然后将培养物放入烘箱，60℃烘干48 h，粉碎，放入密封袋中，存放于4℃冰箱中备用。

1.2.2.3 ZD-5液体、固体菌种

制备方法同ZD-3。

1.2.2.4 ZD-8固体菌种

称取棉籽饼粕底物100 g放入500 ml三角瓶中，加入70 ml蒸馏水，搅拌均匀，0.056 MPa、112.6℃蒸汽灭菌20 min。底物冷却后称取1 g黑曲霉菌种接入经高压灭菌过的100 g棉籽饼粕底物中，在500 ml三角瓶中30℃恒温静止培养24 h，观察三角瓶中是否泛白，如果泛白证明有黑曲霉菌生长。培养结束后，将培养好的黑曲霉固体菌种放入烘箱中，40℃烘干24 h，粉碎，放入密封袋中，存放于4℃冰箱中备用。

1.2.3 复合菌种发酵

1.2.3.1 ZD-3与ZD-5二级菌种复合固体发酵试验设计

ZD-3和ZD-5二级菌种添加的总量为5 ml，二级菌种添加比例为 3： 2、3： 1、2： 1、1： 1、1： 2、1： 3、2：3，即上述两种二级菌种的添加量分别为3 ml和2 ml；3.75 ml和 1.25 ml；3.33 ml和 1.67 ml；2.5 ml和2.5 ml；1.67 ml和 3.33 ml；1.25 ml和 3.75 ml；2 ml和3 ml。试验菌种按上述各比例接入到高压灭菌过的100 g棉籽饼混合底物中，混合均匀，在500 ml三角瓶中30℃恒温静止培养48 h，设3个重复。发酵结束后，将发酵棉籽饼混合底物及未发酵底物(对照)放入烘箱中，60℃烘干48 h，粉碎，过60目筛制样。

1.2.3.2 ZD-3与ZD-8固体菌种复合固体发酵试验设计

ZD-3与ZD-8固体菌种添加总量为1 g，添加比例为 3： 2、3： 1、2： 1、1： 1、1： 2、1： 3、2： 3，即上述两种二级菌种的添加量分别为0.60 g和0.40 g；0.75 g和 0.25 g；0.67 g 和 0.33 g；0.50 g 和 0.50 g；0.33 g 和0.67 g；0.25 g和 0.75 g；0.40 g和 0.60 g。试验菌种按上述各比例接入到高压灭菌过的100 g棉籽饼混合底物中，混合均匀，在500 ml三角瓶中30℃恒温静止培养48 h，设3个重复。发酵结束后，将发酵棉籽饼混合底物及未发酵底物(对照)放入烘箱中，60℃烘干48 h，粉碎，过60目筛制样。

1.3 试验测定指标

测定棉籽饼混合底物发酵前后TG、FG、BG含量。其中 TG采用 ISO6866—1985方法测定、FG采用GB13086—1991方法测定、BG按照公式BG=TG－FG计算得出。因为发酵产物比发酵前重量减少，为了使数据表示更准确，所以发酵后产物总棉酚、游离棉酚和结合棉酚含量采用校正含量表示，单位是mg/kg。

发酵后底物中TG(FG、BG)校正含量(mg/kg)=发酵后底物TG(FG、BG)单位含量×回收率；

1.4 数据统计分析

采用DPS统计软件对试验数据进行方差分析及多重比较（LSD），所有数据均采用平均数±标准误差（Mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 ZD-3与ZD-5复合发酵产物回收率的变化(见表1)

表1 不同比例的ZD-3和ZD-5发酵产物发酵前后的重量及其回收率（风干物质计）

由表1可知，添加不同比例的热带假丝酵母、酿酒酵母复合菌种发酵棉籽饼混合底物后，除ZD-3与ZD-5之比为2：3组外，各发酵组之间回收率差异极显著(P＜0.01)，回收率在 82.36%～83.33%之间。ZD-3：ZD-5之比为1：3时棉籽饼混合底物发酵产物回收率较高为83.33%，ZD-3：ZD-5之比为3：2时棉籽饼混合底物发酵产物回收率较低为82.36%，两者之间回收率相差0.97个百分点(P＜0.01)。

2.2 热带假丝酵母与酿酒酵母复合发酵产物中的TG、FG、BG含量的变化(见表2)

由表2可以看出，添加不同比例的热带假丝酵母、酿酒酵母复合菌种发酵棉籽饼混合底物，各发酵组与对照组相比TG、FG、BG含量均极显著降低（P＜0.01），都具有很好的脱毒效果，脱毒率在84.71%～90.82%。各发酵组与灭菌组相比，TG、FG、BG含量均极显著降低（P＜0.01），均具有很好的脱毒效果，脱毒率在65.82%～90.82%。当ZD-3：ZD-5为3：1时，脱毒效果最好，此时FG的含量仅为58.94mg/kg，脱毒率高达90.82%，同灭菌组相比脱毒率增加了25个百分点。

由以上分析可以得出：不同比例的热带假丝酵母、酿酒酵母复合发酵棉籽饼混合底物，均可使发酵产物中的 TG、FG、BG 含量极显著降低（P＜0.01），说明混合底物发酵时FG被降解消除，而不是转变成BG，从而达到脱毒的目的。

表2 热带假丝酵母与酿酒酵母复合发酵对棉籽饼底物中棉酚含量的影响(以风干物质计)

2.3 ZD-3与ZD-8复合发酵产物回收率的变化(见表3)

由表3可以看出，不同比例的热带假丝酵母、黑曲霉复合菌种发酵棉籽饼混合底物，除ZD-3与ZD-8之比为2：1组外，各发酵组之间回收率差异极显著(P＜0.01)，回收率在 80.79%～82.73%之间。ZD-3：ZD-8之比为1：1时棉籽饼混合底物发酵产物回收率较高为82.73%，ZD-3：ZD-8之比为1：3时棉籽饼混合底物发酵产物回收率较低为80.79%，两者之间回收率相差1.94个百分点(P＜0.01)。

2.4 热带假丝酵母与黑曲霉复合发酵产物中的TG、FG、BG含量的变化(见表4)

表3 不同比例的ZD-3和ZD-8发酵产物发酵前后的重量及其回收率（风干物质计）

由表4可以看出，添加不同比例的热带假丝酵母、黑曲霉复合菌种发酵棉籽饼混合底物,与对照组相比 TG、FG、BG 含量均极显著降低（P＜0.01），各发酵组都具有很好的脱毒效果，脱毒率在68.39%～79.61%。各发酵组与灭菌对照组B相比，TG、FG、BG含量均极显著降低（P＜0.01），都具有很好的脱毒效果，脱毒率在65.82%～79.61%。当ZD-3：ZD-8为1：3时，脱毒效果最好，此时FG的含量仅为130.94mg/kg，脱毒率达79.61%，同灭菌组相比脱毒率增加了13.79个百分点。

表4 热带假丝酵母菌与黑曲霉发酵对棉籽粕底物中棉酚含量的影响(以风干物质计)

由以上分析可以得出：不同比例的热带假丝酵母、黑曲霉复合发酵棉籽饼混合底物，均可使产物中的 TG、FG、BG 含量极显著降低（P＜0.01），说明棉籽饼混合底物发酵时FG被降解消除，而不是转变成BG，从而达到脱毒的目的。

3 讨论

微生物固体发酵可显著降低游离棉酚含量已有多篇文献报道，但游离棉酚是被降解消除，还是形成结合棉酚未见报道，总棉酚和结合棉酚的变化规律未见阐明。本研究发现：棉籽饼混合底物经过热带假丝酵母与酿酒酵母或与黑曲霉以不同比例菌种复合发酵后，均可极显著降低发酵产物游离棉酚和结合棉酚含量(P＜0.01)，各处理组都具有很好的脱毒效果，而与混合底物灭菌对照组相比，脱毒率都有所提高。结论表明，棉籽饼及其混合底物经复合菌种发酵后，游离棉酚和结合棉酚含量均极显著降低(P＜0.01)，通过发酵处理，可消除游离棉酚对动物的毒害作用。同时发现，热带假丝酵母与酿酒酵母的复合发酵效果优于热带假丝酵母与黑曲霉的发酵效果，菌种比例对发酵结果有显著影响。

4 结论

①热带假丝酵母与酿酒酵母或与黑曲霉对棉籽饼混合底物进行二元复合发酵，均可极显著降低底物中TG、FG和BG含量，FG和BG的减少部分均被降解消除。

②添加热带假丝酵母与酿酒酵母的复合发酵效果优于添加热带假丝酵母与黑曲霉的发酵效果，并且菌种比例对发酵结果有显著影响。当热带假丝酵母与酿酒酵母的比例为3：1时，脱毒效果最好，脱毒率可达90.82%。

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