朱家校， 何 伟， 李 勇， 姚 曦

(广东药学院药物研究所广东省药物新剂型重点实验室，广东广州510006)

川芎为伞形科藁本属植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的根茎，始载于《神农本草经》。其性温，味辛、微苦，具有活血行气、祛风止痛之功效。主治血瘀气滞所致月经不调、痛经经闭，肝郁气滞而致血行不畅的胸胁疼痛、头痛、风寒湿痹、跌打肿痛等疾病［1］。川芎主要成分是藁本内酯、川芎嗪、阿魏酸等［2-4］，具有保护内皮细胞、抑制脂质过氧化、抗血栓、抗心肌缺血、舒张血管、抑制神经元变性等药理作用［5-10］。

响应面分析法(Response Surface Methology，RSM)是一种优化工艺条件的方法，1951年Box和Wilsond首次用于确定各因素及其交互作用在工艺过程中对响应值的影响［11］。在实验条件寻优过程中，响应面分析法可以连续地对实验的各个水平进行分析，本实验采用响应面分析法，以藁本内酯量为指标在单因素实验的基础上，考察川芎回流提取，提取温度、含乙醇量、提取时间3个因素对提取效果的影响，优选川芎藁本内酯的最佳提取工艺。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Dionex ultimate 3000高效液相色谱仪(光电二极管阵列检测器、Chromeleon色谱工作站);BS224S型电子分析天平(北京sartorius);HWS-12电热恒温水浴锅(普瑞赛斯仪器有限公司)。

1.2 试药 川芎药材(批号:080401)购自广州致信中药饮片有限公司;藁本内酯对照品(批号:0817-9502，供定量测定用)购自天津一方科技有限公司;试剂:甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 藁本内酯测定

2.1.1 色谱条件 色谱柱:Dikma Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相∶甲醇-水(77 ∶23);检测波长:324 nm;柱温:30 ℃;体积流量:1.0 mL/min，进样量:10 μL;理论塔板数按藁本内酯计不应低于5000。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取川芎药材粗粉10.0 g，平行2份，置圆底烧瓶中，准确加入一定量和一定浓度的乙醇，回流提取2次，每次一定时间，滤过，合并滤液，定容，摇匀，精密吸取5 mL，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.1.3 标准曲线的绘制 精密称取藁本内酯对照品20 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，作为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2、3、5、10、15、20 μL 注入液相色谱仪中，测定藁本内酯色谱峰面积，以藁本内酯微克数为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，得回归方程为:Y=41.298 X-0.1269，r=0.9999。表明藁本内酯在 0.1600 μg ～1.600 μg 范围内呈良好线性关系。

2.1.4 定量测定 精密吸取供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪中，测定藁本内酯色谱峰面积，计算藁本内酯量。

2.2 单因素试验确定主要影响因素及范围

2.2.1 提取溶剂的影响 固定提取温度为80℃，提取时间为2.0 h，料液比为1∶25，分别以水、甲醇、乙醇、丙酮为提取溶剂，加热回流提取，以观察不同溶剂对藁本内酯提取效果的影响(见图1，n=3)。从图1结果可以看出，当用甲醇或乙醇作为提取溶剂时，藁本内酯的提取量较高。由于甲醇具有一定的毒性，故选用乙醇作为提取溶剂。

2.2.2 提取温度的影响 固定提取时间为2.0 h，料液比为1∶25，含乙醇量为70%，改变提取温度，以观察其对藁本内酯的提取效果的影响(见图2-A，n=3)。从图2-A结果可以看出，在一定温度范围内，随提取温度的升高，藁本内酯的提取量逐渐增加。当提取温度超过80℃时，藁本内酯提取量变化不明显。因此，将响应面试验中的提取温度设定在70℃ ～90℃之间。

图1 不同提取溶剂对藁本内酯提取量的影响

2.2.3 提取时间的影响 固定提取温度为80℃，料液比为1∶25，含乙醇量为70%，改变提取时间，以观察其对藁本内酯的提取效果的影响(见图2-B，n=3)。从图2-B结果可以看出，提取时间过短，藁本内酯提取不完全;提取时间超过2 h后，藁本内酯提取量的变化不明显。因此，将响应面试验中的提取时间设定在1.5～2.5 h之间。

2.2.4 含乙醇量的影响 固定提取时间为2.0 h，提取温度为80℃，料液比为1∶25，改变含乙醇量，以观察其对藁本内酯提取效果的影响(见图2-C，n=3)。从图2-C结果可以看出，含乙醇量升高，藁本内酯提取量逐渐增加，70%乙醇提取量最高，但当含乙醇量继续增大时，藁本内酯提取量明显减少。因此，将响应面试验中的含乙醇量设定在50% ～90%之间。

图2 不同试验因素对藁本内酯提取量的影响

2.2.5 料液比的影响 固定提取时间为2.0 h，提取温度为80℃，含乙醇量为70%，改变料液比，以观察其对藁本内酯的提取效果的影响(见图2-D，n=3)。从图2-D可以看出，料液比为1∶25时，藁本内酯提取量最高，料液比对藁本内酯提取效果的影响程度比其他因素要小，为了减少实验次数，所以提取工艺中料液比固定为1∶25。

2.3 中心组合设计-响应面分析法优化提取工艺条件

2.3.1 试验设计及结果 根据Box-Behnken中心组合设计的原理和单因素试验结果，选取进取温度、含乙醇量和提取时间3个对藁本内酯提取量影响较大的因素，进行3因素3水平(共15个试验点，3个中心点)的响应面试验，应用Design-Expert7.16软件进行数据分析，确定川芎中藁本内酯的最佳提取条件。试验设计与结果见表1、2。

2.3.2 模型拟合与显著性检验 将所得数据采用Design-Expert7.16软件对表2中进行数据进行二项式拟合回归，得到以藁本内酯提取量(Y)为响应值，3个参数为自变量的二次回归模型方程为:

表1 中心组合试验设计因素水平编码表

为检验方程的有效性，对川芎藁本内酯提取的数学模型进行方差分析，由表3可知，模型的P值小于0.01，表明二次方程拟合高度显著，失拟项F值为12.02，显示失拟项相对绝对误差不显著，而不显著的失拟项才合理。提取温度及提取时间对藁本内酯的提取量有显著影响;二次项X22影响极显著;交互项按影响大小排序依次为X1X2、X2X3、X1X3。由图3可知，随含乙醇量的增加，藁本内酯的提取量先升高后降低，说明藁本内酯具有一定的极性;提取时间的延长，藁本内酯的提取量先升高后降低，藁本内酯在较高温度的条件下不稳定。剔除不显著项后即得回归方程式(2)。简化的方程R=0.9608，降幅较小，说明此方程的可信度高。

表2 中心组合试验设计与结果

表3 川芎藁本内酯提取回归模型方差分析

2.4 最佳提取工艺验证试验 通过回归模型预测的川芎藁本内酯提取的最佳工艺条件为:提取温度88.87℃，含乙醇量70.72%，提取时间2.3 h，料液比1 ∶25，提取2 次，预测值为6.8696 mg/g。考虑到实际操作的可行性，将川芎藁本内酯提取的提取条件在回归方程得到的理论值基础上修正为:提取温度 89℃，含乙醇量71%，提取时间2.3 h，料液比1∶25，提取2次，采用此工艺条件进行验证实验(n=3)，藁本内酯提取量分别为 6.84，6.83，6.83mg/g，均与预测值相差不大，说明本实验所建模型得到的工艺参数准确可靠。

图3 各因素两两交互作用对藁本内酯提取量影响的响应面图

3 讨论

传统的数理统计往往采用正交设计或均匀设计［12］，寻求最佳的因素水平组合，即用线性数学模型进行拟合，试验次数虽少，但不能在设定的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域上的因素的最佳组合和响应的最优值。响应面分析法克服了正交设计和均匀设计的缺陷，通过采用非线性拟合的中心组合-效应面法研究各因素间相互作用的一种回归分析方法。响应面分析法亦有其局限性:设计的试验点应包括最佳的实验条件，如果实验点的选取不当，应用响应面分析法也不能得到很好的优化结果。因此，本实验首先以单因素试验确定主要影响因素及范围，在单因素实验的基础上，应用响应面分析法考察药材的提取温度、含乙醇量、提取时间3个因素对提取效果的影响，优选藁本内酯的最佳提取工艺，有效地改善了提取效果，具有较大的实用价值。

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