王园园，李云河，陈秀萍，武红巾，彭于发

中国农业科学院植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

在害虫综合防治(IPM)技术中，利用传统育种方法发展抗虫作物，如小麦、玉米、水稻、苜蓿等，曾发挥了巨大的作用(Dhaliwal＆Singh，2005)，主要体现在减少农药施用量、保护生态环境、降低投入、增加农民收入等方面(Barfoot＆ Brookes，2010)。据估计，在美国，抗虫小麦的利用每年可以为农民增加1.9亿美元的收入(Smith，2005)。但是，利用传统育种方法获得抗性品系有很大局限性。第一，抗性基因的转移仅限于异花授粉的植物物种之间;第二，一些自然发生的抗性基因仅限于目标植物的远源物种或近缘野生物种，几乎没有可能或很难高效地把这些基因通过异花授粉方式转入目标植物，并使其稳定遗传和表达;第三，难以获得较高的抗虫特性。另外，传统育种过程非常复杂、费时费力。

基因重组技术(recombination DNA technology)的出现，使作物育种更简单、快捷。1987年Vaecket al.首次将土壤苏云金杆菌Bacillus thunringiensis杀虫蛋白基因导入烟草，获得具有抗烟草天蛾Manduca sextaL.的转基因Bt烟草品系。自此，转基因生物技术得到了突飞猛进的发展，许多编码杀虫蛋白(如Cry蛋白、蛋白酶抑制剂和植物凝集素等)的抗虫基因被转入不同植物中(Maloneet al.，2008)。自1996年转基因Bt作物在美国首次商业化种植以来，转基因抗虫作物在全球的种植面积持续快速增长(James，2010)。转Bt抗虫植物的种植能有效减少广谱化学杀虫剂的施用，保护人类健康和生态环境平衡(Barfoot＆Brookes，2010)。例如，Bt棉花在美国商业化种植后，用于控制棉花害虫的杀虫剂施用次数从平均每年4.6次(1992～1995年)下降到 0.8次(1999～2001年)(FAOUN，2004)。在我国，Bt棉花的种植使棉田农药总施用量下降了60% ～80%(Fit，2004)。

转基因抗虫植物的利用是作物害虫防治技术的一次巨大绿色变革。然而，像其他害虫防治措施一样，其为人类带来利益的同时，也可能会对环境造成潜在的生态风险。转基因抗虫作物的环境风险问题主要包括杂草性问题、基因漂移、非靶标生物影响、靶标害虫抗性进化、对生物多样性的影响等。近20年来，国内外已开展了大量的实验室和田间试验，来评价转基因抗虫植物对生态环境的潜在风险。其中，转基因抗虫作物的非靶标生物影响一直是相关研究者关注的焦点(Romeiset al.，2008;Wolfenbargeret al.，2008)，研究工作主要集中在对农田生态体系发挥重要功能的害虫天敌(捕食者和寄生者)、传粉者(蜜蜂和蝴蝶)和经济昆虫(家蚕)等的影响方面。因此，在任何转基因作物商业化利用之前都必须通过系统深入的环境安全性评价(Romeiset al.，2008;彭于发等，2008)。本文就评价转基因作物对农田有益节肢动物影响方面的试验方法、程序和技术做简要概括和分析，并对当前已经商业化种植的2例转基因抗虫作物(Bt玉米和Bt棉花)的非靶标生物影响方面的研究进行综合分析和探讨，以期为我国相关科研工作者提供参考，并为完善我国的转基因作物风险评价理论及风险管理方法提供依据。

1 风险评价一般原理

风险是由危险和实现这种危险的可能性组成的，两者缺一，风险就不能确立。因此，风险评价就是鉴定某个危险对人类或环境的危害性及该危害发生的可能性(Garcia-Alonsoet al.，2006)。具体到评价转基因抗虫作物的非靶标生物影响，就是鉴定转基因表达的杀虫蛋白对该生物的毒性(toxicity)和该生物暴露(exposure)于杀虫蛋白的途径和程度，然后根据2个方面的研究数据综合分析转基因作物的种植对该非靶标生物产生的生态后果(Duttonet al.，2003;Garcia-Alonsoet al.，2006;Romeiset al.，2008)。

1.1 杀虫蛋白对非靶标生物的毒性鉴定

研究转基因作物外源杀虫蛋白对某生物的毒性，先要收集现有信息，弄清杀虫蛋白的作用方式、毒理特性(如引起生物死亡和延迟发育等)，确定潜在的敏感生物和外源杀虫蛋白可能的释放环境等因素。根据这些信息，设计合适的试验方法，选择具有代表性的受试生物，确立受试生物在生测体系中暴露于杀虫蛋白的时间以及选择合适的评价指标(assessment endpoints)等(USEPA，2007;Romeiset al.，2008)。例如，不同的Bt蛋白作用机制可能有所不同，但其毒理特性基本一致。通过综合分析现有数据，就可以选择合适的受试生物，制定合适的试验方案。

1.2 非靶标生物暴露于杀虫蛋白的程度鉴定

鉴定非靶标节肢动物暴露于外源杀虫蛋白的途径和程度是一个复杂的过程，需要综合考虑和评价抗虫转基因作物的生理生化、遗传特性、生存环境及其与非靶标生物的直接和间接关系等因素(USEPA，2007)。一个非靶标生物暴露于植物外源杀虫蛋白的程度取决于其所接触杀虫蛋白的浓度、时间和频率。非靶标生物暴露于转基因植物表达的外源杀虫蛋白的途径有直接和间接2种方式。直接方式如通过直接取食转基因植物组织(Liet al.，2008);间接方式如害虫天敌(捕食者和寄生者)通过捕食和寄生取食过转基因作物组织的植食性害虫等(Li＆Romeis，2010)。因此，评价非靶标生物暴露于转基因植物外源杀虫蛋白的程度，不但要弄清杀虫蛋白在转基因植物组织中的时空表达模式、表达浓度和所释放的环境，还要弄清楚这些外源杀虫蛋白在环境中的传递、降解、累积、存在方式和状态 (Liet al.，2007;Zurbrügg ＆ Nentwig，2009)，以及目标生物的生物学特性。

2 分层次的评价程序

目前，在研究转基因植物对非靶标生物的影响方面，被风险评价工作者和相关转基因植物管理部门广泛接受的是分层次评价体系(Garcia-Alonsoet al.，2006;Romeiset al.，2008;USEPA，2007)。简单地说，该研究体系就是先选择合适的受试生物，然后依次开展从实验室试验(lower-tier)到半田间试验(middle-tier)，再到田间试验(higher-tier)的分层次、分阶段进行的系统评价(图1)。

图1 评价转基因抗虫作物对非靶标生物影响的一般程序Fig.1 General procedure for assessing the non-target effects of insect-resistant transgenic plants

2.1 非靶标受试生物的选择

农田有益节肢动物种类繁多，不可能对每个物种都进行安全性评价。因此，选择合适的具有农田生态和经济重要性的节肢动物物种作为指示生物(indicator species)是评价转基因植物非靶标生物影响的重要环节(Romeiset al.，2008)。选择指示性生物一般可遵循几个标准:(1)所选择的受试物种应该具有重要生态功能，如对害虫具有控制作用的天敌、传粉昆虫、土壤中的腐蚀生物等;(2)具有美学价值和被鉴定为稀有或濒危的生物物种;(3)评价转基因植物对非靶标生物的影响，主要关注的是转基因植物对非靶标生物的直接影响，也就是转基因植物表达的外源杀虫蛋白对某生物的直接毒性，因此，在农田系统中较多暴露于杀虫蛋白的非靶标生物更应该成为评价对象;(4)在试验操作中应具有便利性和可行性，一般来说，易于在实验室饲养、在试验中易处理和观察的非靶标生物应该被优先考虑作为指示性生物(USEPA，2007;Romeiset al.，2008)。

2.2 实验室试验

实验室试验的主要目的是研究转基因植物表达的杀虫蛋白对受试生物是否具有毒性。试验一般要求在可控的环境条件中进行，对试验设计要求较高，试验应该完全可以被重复(Romeiset al.，2011)。受试生物一般被暴露在比其在田间环境中实际接触的杀虫蛋白浓度高的条件下(worst-case situation)。在生物测定试验中，研究者一般采用的杀虫蛋白剂量高于植物组织中最高表达浓度的10倍(USEPA，2001)。如有合适的人工饲料，一般采用将纯化后的杀虫蛋白加入人工饲料直接饲喂受试生物的方法进行试验(Romeiset al.，2004;Liet al.，2008;Duanet al.，2008)。如果没有合适的人工饲料，可以考虑通过三级营养体系进行试验，即把高剂量的杀虫蛋白饲喂给受试生物的猎物或寄主，通过猎物或寄主把高浓度的杀虫蛋白传递给其天敌(Duttonet al.，2003;Chenet al.，2008)。在这样的试验体系中，必须要弄清猎物或寄主传递给天敌的实际剂量和杀虫蛋白的生物活性状况。另外，研究中发现的负面影响可能是源于杀虫蛋白的直接毒性(direct toxicity)，也可能是源于取食了杀虫蛋白的猎物或寄主营养质量下降(prey/host-mediated effect)(Duttonet al.，2002;Hilbecket al.，1998;Romeiset al.，2006)。因此，很多研究者建议选择对杀虫蛋白不敏感或已经产生抗性的昆虫作为猎物或寄主(Chenet al.，2008;Li＆ Romeis，2010)。

2.3 半田间试验

如果实验室试验能确定受试非靶标生物对转基因植物表达的杀虫蛋白不敏感，一般来说，评价工作可以就此终止;但如果检测到负面影响，或者对研究结论不完全确定，应该重新设计，开展更严格的实验室试验，或者进入下一个评价阶段，开展与大田环境接近的半田间试验(Duttonet al.，2003;Romeiset al.，2008、2011)。这类试验一般在玻璃室、网室等环境中进行。试验中，需要充分考虑受试生物在自然条件下实际暴露于杀虫蛋白的途径和程度，使试验结果更能体现自然实际情况。试验可以通过直接饲喂受试生物转基因植物组织如花粉(Liet al.，2008)或取食过转基因植物的猎物或寄主(Li ＆ Romeis，2010; Álvarez-Alfagemeet al.，2011)的方式进行。研究中要弄清受试生物实际暴露于杀虫蛋白的浓度，一般通过生化试验手段(ELISA＆Western-blotting)追踪和鉴别杀虫蛋白在整个食物链中的传递和生物活性状态(Li＆Romeis，2009、2010; Álvarez-Alfagemeet al.，2011)。

2.4 田间试验

同样，如果在半田间试验中未检测到转基因作物对受试生物的负面影响，或者影响微弱至可以忽略不计，即可终止评价工作(Romeiset al.，2008;USEPA，2007)。但有些研究者认为，实验室和半田间试验不能代表田间实际环境，其研究结论有待田间试验的验证(Andow＆Hilbeck，2004)。在田间试验中，一般通过调查转基因植物和非转基因亲本植物田间非靶标生物的群体动态如种群密度、种群多样性等参数，研究转基因植物的种植可能造成的生态风险。值得说明的是，由于田间生物种群动态受到生物或非生物、直接或间接等多种复杂因素的影响，很难把生物群体的改变与某个单一影响因素联系起来。因此，很难对田间调查数据进行准确的分析和合理的解释。这样的研究一般需要多年的重复试验(Perryet al.，2009;Wuet al.，2008;Luet al.，2010)。

3 商业化种植的转基因抗虫作物对非靶标节肢动物的生态影响

3.1 Bt玉米的非靶标影响

当前，根据所表达杀虫蛋白的靶标害虫种类，将全球已注册的转Bt基因抗虫玉米品种分为2类。(1)表达Cry1、Cry2或Cry9类杀虫蛋白。如孟山都公司(Monsanto)生产的MON810表达Cry1Ab蛋白，DeKalb Genetics公司生产的 CBH351表达Cry9C蛋白，Pioneer-Hi-Bred生产的 TC1507表达Cry1F 蛋白等(Hellmichet al.，2008)。这些Bt蛋白对鳞翅目害虫如亚洲玉米螟Ostrinia furnacalisGuenée等有杀虫活性。(2)表达 Cry3、Cry34 或Cry35类杀虫蛋白。如 Monsanto公司生产的MON88017和MON863表达 Cry3Bb1蛋白，Pionerr Hi-Bred公司生产的 DAS-59122-7表达 Cry34/35Ab1蛋白。这类杀虫蛋白对鞘翅目如玉米根萤甲虫Diabrotica virgijeraLeconte具有杀虫活性(Hellmichet al.，2008)。转Bt玉米于1996 年在美国开始商业化种植，至2008年，全球种植Bt玉米的国家已有13个，种植总面积达3.5千万 hm2(James，2010)。研究表明，转基因Bt玉米的种植有效地控制了玉米重要害虫，提高了玉米产量。另外，由于化学农药施用量的减少，降低了玉米生产成本，提高了农民收入，同时也改善了农田生态环境，保护了种植者的健康(Barfoot＆ Brookes，2010)。

转基因抗虫玉米对非靶标节肢动物，特别是对在农田系统中起到重要生态功能的功能团，如害虫天敌、传粉者、经济昆虫等的影响，引起了生物学家和环境风险评价者的广泛关注(Romeiset al.，2006、2008)。大量的研究数据表明，Bt玉米表达的Cry杀虫蛋白对害虫天敌没有毒性(Hellmichet al.，2008);同时，田间试验也证实，与施用农药的非转基因玉米相比，Bt玉米的种植能提高玉米田的生物多样性(Romeiset al.，2006;Marvieret al.，2007;Hellmichet al.，2008)。由于玉米花粉产量很高，在一些玉米品种如MON88017花粉中，Bt杀虫蛋白的表达量很高，一些以玉米花粉为食的有益生物就会因取食玉米花粉而暴露于Bt杀虫蛋白(Liet al.，2008;Li＆Romeis，2010)。但实验室生测结果表明，Bt玉米花粉对瓢虫Coleomegilla maculataDe-Geer(Duanet al.，2002;Lundgren ＆ Wiedenmann，2002)、普通草蛉Chrysoperla carneaStephen成虫(Liet al.，2008)、蜜蜂幼虫和成虫(Duanet al.，2008)均没有毒性。

一些研究者也报道了Bt玉米对非靶标节肢动物的负面影响。如Hilbecket al.(1998)报道了Bt玉米表达的Cry1Ab蛋白对普通草蛉幼虫有负面影响。但该报道引起的一系列后续试验证明，Cry1Ab对普通草蛉幼虫没有直接毒性(Duttonet al.，2002;Romeiset al.，2004;Rodrigo-Simonet al.，2006)。用取食过Bt玉米的二斑叶螨(对Cry1Ab不敏感)和海灰翅夜蛾(对Cry1Ab敏感)饲喂草蛉幼虫发现，取食海灰翅夜蛾幼虫的草蛉生长发育受到负面影响，而取食二斑叶螨的草蛉生长发育未受任何影响，尽管 ELISA检测结果显示二斑叶螨体内的Cry1Ab蛋白含量明显高于海灰翅夜蛾(Duttonet al.，2002)。这些结果说明，此前发现的负面影响并不是Cry1Ab造成的，而是由于试验中所用猎物对Cry1Ab蛋白敏感而使其生长发育受到影响，进而间接地影响了捕食者的生长发育(Romeiset al.，2006;Lawoet al.，2010)。 此 外，Loseyet al.(1999)也发现，取食表面附有Bt玉米花粉的马利筋草的帝王斑蝶Danaus plexippusLinnaeus幼虫死亡率明显提高，进而得出Bt玉米的种植可能会导致帝王斑蝶种群数量降低的结论。然而，一系列更详细的研究发现，由于帝王斑蝶幼虫暴露于玉米花粉的程度极其有限，且Bt玉米花粉对斑蝶幼虫的毒性较低，Bt玉米的种植几乎不会对帝王斑蝶种群数量产生负面影响(Hellmichet al.，2001;Oberhauseret al.，2001;Searset al.，2001;Zangerlet al.，2001;Woltet al.，2003)。尽管如此，由于Bt玉米event 176花粉中Cry1Ab蛋白表达量很高，可能会对帝王斑蝶幼虫产生急性毒性影响(Zangerlet al.，2001;Hellmichet al.，2001)，该玉米品种已退出市场。另外，最近有研究发现，取食外壁包裹Cry1Ab或Cry3Bb1杀虫蛋白的地中海斑螟Ephestia kuehniellaZeller卵的二星瓢虫Adalia bipunctataLinnaeus幼虫死亡率明显提高(Schmidtet al.，2009)。然而，由于该试验中受试昆虫暴露于杀虫蛋白的实际浓度不明确及对照组中的高死亡率(21%)，使得很多相关研究者对试验方法和结论产生质疑(Ricrochet al.，2010)。更系 统的研 究证明，Cry1Ab 和Cry3Bb1对二星瓢虫并没有毒性，所报道的负面影响可能源于试验设计和方法的不完善(Álvarez-Alfagemeet al.，2011)。

3.2 Bt棉花的非靶标影响

目前，全球种植的Bt棉花品种主要有2大类，即表达1个外源Bt基因(cry1)的第1代转基因抗虫棉和表达2个外源基因(cry1+cry2)的第2代转基因抗虫棉。第1代Bt棉的靶标害虫主要包括棉铃虫Helicoverpa armigeraHübner、棉红玲虫Pectinophora gossypiellaSaunders和多种棉金刚钻Eariasspp.等。然而，第1代单基因抗虫棉对甜菜夜蛾Spodoptera exiguaHubner、斜纹夜蛾Spodoptera lituraFabricius及小地老虎Agrotis ypsilonRottemberg等的防治效果较差。转双基因的第2代抗虫棉对鳞翅目棉花害虫的杀虫谱增宽，涵盖了多种一代抗虫棉不能有效控制的棉花害虫，并提高了对棉铃虫的防效(Naranjoet al.，2008)。另外，由于第2代转基因抗虫棉表达的2个Bt基因(cry1Ac和cry2Ab)与靶标害虫中肠的结合位点不同，一般认为不会产生交互抗性。因此，双基因抗虫棉的利用可能会有效地延迟靶标害虫对Bt棉花的抗性进化(Liuet al.，2005)。自1996年Bt棉花在美国、澳大利亚和墨西哥商业化种植以来，其在全球的种植面积逐年增加。2009年，全球有11个国家种植Bt棉花，种植总面积达1500万hm2，大约占全球棉花总种植面积的50%(Naranjo，2010)。Bt棉花的利用有效地控制了棉花重要害虫的发生，大大降低了化学农药的使用。据统计，1996～2008年，Bt棉花的种植减少了1.4亿kg化学农药活性成分的施用(Barfoot＆Brooks，2010)。

近10年来，国内外风险评价工作者对转基因Bt棉花的非靶标生物影响做了较为充分的研究，已有上百篇相关文章发表。通过综合分析这些研究数据发现，转基因Bt棉花表达的外源杀虫蛋白的专一性非常强，对非靶标生物没有直接的影响(Romeiset al.，2006;Naranjoet al.，2008)。但也有极少部分研究报道了Bt棉花对捕食性天敌如花蝽Orius tristicolor(White)(Ponsardet al.，2002)和寄生性天敌缘腹绒茧蜂Cotesia marginiventris、佛州点缘跳小蜂Copidosoma floridanum、棉铃虫齿唇姬蜂Campoletis chlorideaeUchida(Baur ＆ Boethel，2003;Liuet al.，2005)等的负面影响。分析发现，这些试验中采用的天敌猎物或寄主对Bt棉花所表达的杀虫蛋白敏感，而在利用对Bt蛋白不敏感的昆虫作为天敌猎物和寄主的研究中却未发现负面影响(Li＆Romeis，2010)。这说明其负面影响是由于试验中所利用的猎物或寄主对Bt蛋白敏感而营养质量下降，进而造成对昆虫天敌的间接影响，并不是Bt蛋白对昆虫天敌产生的直接毒性(Romeiset al.，2006;Naranjo，2009)。除了实验室试验，研究者还开展了大量的田间试验，以研究Bt棉花对棉田体系中非靶标生物种群动态的影响(Naranjo，2005)。大量的数据分析(meta-analysis)显示，与未施用杀虫剂的非Bt棉田相比，Bt棉花对棉田非靶标节肢动物没有明显影响，而杀虫剂对棉田非靶标生物的影响远远超过Bt棉花(Wolfenbargeret al.，2008)。总之，综合大量的研究数据表明，转Bt棉花的种植对棉田害虫天敌不会造成直接的负面影响 (Marvieret al.，2007;Wolfenbargeret al.，2008)。

当然，转基因抗虫作物引起的靶标害虫数量的下降、化学农药施用量的减少，将可能导致农田生物群落结构的变化。如Wuet al.(2008)报道，Bt棉花的利用有效控制了棉铃虫的发生，但由于用于控制棉铃虫的化学农药施用量的下降，导致原本在棉田发生不严重的盲蝽象成为棉田主要害虫(Luet al.，2010)。这说明，转基因抗虫作物不是，也不可能是一劳永逸的害虫控制措施，它只能作为IPM策略中的一个组成部分，应与其他害虫控制措施有机结合，对害虫群体进行有效调控。

4 小结

基因重组技术的发展为害虫控制提供了一个有效的途径。通过基因重组技术培育的转基因抗虫作物如Bt棉花和Bt玉米已经在全世界多个国家开始种植，种植面积也逐年增多，给种植者带来了巨大的利益，也改善了生态环境。但是，转基因作物对环境可能造成的生态风险也不容忽视。因此，在每例转基因作物商业化释放前都必须通过严格的环境安全评价。在评价转基因抗虫作物对非靶标生物风险时，需要充分考虑转基因作物及其表达的外源杀虫蛋白的特性，及其与非靶标受试生物的关系，制定出合理、完善、具有可操作性、可重复的试验方案，进而得出可靠的、能真实体现客观事实的研究结论(Álvarez-Alfagemeet al.，2011;Romeiset al.，2011)。大量的实验室和田间试验表明，当前已经商业化释放的转基因抗虫作物(Bt棉花和Bt玉米)不会对农田非靶标有益生物产生直接的负面影响。同时，Bt作物的种植减少了广谱化学农药的使用，这将提高农田有益生物如害虫天敌的种群密度，加强控制害虫的功能。因此，转基因抗虫作物将作为IPM策略中的一个组成部分，有望与其他害虫控制措施相结合，加强对害虫的有效控制。

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