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盐酸法舒地尔对大鼠癫痫持续状态海马神经元的保护作用

2011-06-30郑辑英李光来薛国芳郝庆伟

中西医结合心脑血管病杂志 2011年9期
关键词:舒地尔阳性细胞结构域

耿 瑜,郑辑英,李光来,薛国芳,郝庆伟

癫痫持续状态(SE)是指连续癫痫发作持续30min或者在其两次或者多次发作的间歇期意识没有完全恢复的状态。SE有很高的致残率和致死率,探索新的更加有效的SE后神经元保护方法有着重要临床意义。盐酸法舒地尔是一种异喹啉磺胺衍生物,主要是通过抑制Rho激酶发挥作用,具有扩张血管、改善脑循环、减轻缺血损伤的作用。本实验旨在观察SE后大鼠脑组织凋亡相关基因XIAP、Caspase-9的表达情况,探讨盐酸法舒地尔干预对SE导致的神经元损伤的影响及其可能的机制,以期为盐酸法舒地尔应用于临床SE的治疗提供可能的动物实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年Wistar大鼠54只,体重220g~240 g(山西医科大学实验动物中心提供),氯化锂(中国医药集团上海制剂公司),匹罗卡品(美国Sigma公司),免疫组化试剂盒、DAB显色剂及多聚赖氨酸、Caspase-9一抗(BA2216)、XIAP一抗(BA2621,武汉博士德生物有限公司),盐酸法舒地尔(天津红日医药有限公司)。

1.2 动物分组及模型的建立 Wistar大鼠随机分为对照组(A组)、模型组(B组)、盐酸法舒地尔组(C组)。后两组再随机分为4个亚组:分别用于SE后6h、12h、24h和48h时点。采用国内外公认的氯化锂-匹罗卡品癫痫持续状态动物模型:按体重127mg/kg,18h后经腹腔注射新鲜配制的匹罗卡品30mg/kg。造模成功后所有大鼠随机分为模型组、盐酸法舒地尔组。盐酸法舒地尔组于达癫痫持续状态1h后采用腹腔注射给药50mg/kg,模型组和对照组1h后腹腔注射等量生理盐水。惊厥评分采用Racine评分法,痫性发作行为分级6级。痫性发作持续超过30 min为SE。在SE达1h时,予腹腔注射地西泮10mg/kg,终止痫性发作。

1.3 标本处理 在SE后相应时间点各取大鼠6只,用25%乌拉坦4mL/kg深麻醉后,断头取脑,大鼠脑组织置入4%多聚甲醛中固定,常规脱水、透明、浸蜡、包埋后,在视交叉后海马区连续冠状切片,每片厚5μm。HE染色,光镜下观察形态学变化。

1.4 细胞凋亡检测 采用原位缺口末端标记法(TUNEL法)检测,按试剂盒(POD)提供方法操作,细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞,即凋亡细胞计数5个高倍视野下的凋亡细胞数,凋亡指数(apoptosis index,AI)以凋亡细胞/100个细胞表示。

1.5 免疫组化检测 采用SP法,染色步骤按试剂盒说明书进行。显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞,每只动物随机取3张切片,每张切片在400倍视野下随机选取不重叠的5个视野,图像输入计算机,采用彩色图像分析系统,分别计数XIAP和Caspase-9染色阳性细胞数,取均数。

2 结 果

2.1 行为学表现 B组大鼠注射匹罗卡品后15min~30min均出现流涎、点头、洗脸样动作;随后出现前肢阵挛,之后很快表现为前肢阵挛伴站立,进一步发展到全身强直阵挛发作伴站立、摔倒,反复发作,均达到Ⅳ级~Ⅴ级发作,呈癫痫持续状态,点燃率为100%。C组大鼠也均达到癫痫持续状态,但潜伏期较长且痫性发作程度较B组轻,多在Ⅲ级~Ⅳ级发作。A组大鼠无癫痫发作。

2.2 TUNEL检测结果 A组仅有少量TUNEL阳性细胞表达,呈散在分布,着色较浅。B组6hTUNEL阳性细胞表达开始增多,并随时间点的延长而增加,24h达高峰,48h减少,与B组相比,C组TUNEL阳性细胞也是在24h达高峰,但相应时间点TUNEL阳性细胞的表达均低于B组(P<0.0 5或P<0.01)。详见表1。

表1 3组大鼠SE后海马TUNEL阳性细胞数(±s)

表1 3组大鼠SE后海马TUNEL阳性细胞数(±s)

组别6h 12h 24h 48h A组1.87±0.26 B组 14.93±1.03 28.53±1.37 36.61±1.38 28.35±1.20 C组 13.30±1.22 17.66±1.16 27.49±1.34 19.83±1.12 P<0.05 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 AP和Caspase-9检测 A组大鼠海马未见XIAP和Caspase-9阳性细胞出现。B组6h有大量XIAP和Caspase-9阳性细胞出现,12h到达高峰;C组与B组相比,各时间点XIAP阳性细胞数均显著增加(P<0.05),Caspase-9阳性细胞数均显著减少(P<0.05)。详见表2、表3。

表2 B组与C组大鼠SE后海马XIAP阳性细胞数(±s)

表2 B组与C组大鼠SE后海马XIAP阳性细胞数(±s)

组别6h 12h 24h 48h B组 13.28±6.47 22.12±7.25 15.97±8.12 10.51±4.31 C组 24.51±9.07 39.30±12.94 22.77±12.23 19.99±4.42 P<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

表3 3组大鼠SE后海马Caspase-9阳性细胞数(±s)

表3 3组大鼠SE后海马Caspase-9阳性细胞数(±s)

组别6h 12h 24h 48h B 组 34.92±10.77 54.01±14.11 41.35±10.59 38.85±9.76 C组 20.58±7.53 36.37±12.57 28.07±7.37 20.13±9.08 P<0.05 <0.05 <0.05 <0.05

3 讨 论

目前认为至少有三条信号通路参与细胞的凋亡:线粒体通路、死亡受体通路、内皮网通路。Caspase是细胞凋亡的核心,在这三条凋亡通路中几乎涉及Caspase的级联反应[1]。凋亡过程可划分为启动、效应、降解3个功能截然不同的阶段,而Caspase-9是最主要的凋亡启动分子,是线粒体凋亡途径的关键蛋白酶,处于Caspase“瀑布式”的顶端,它可以启动Caspase的级联反应,并激活下游的Caspase-3,从而完成对其相应底物的切割,引起细胞凋亡[2]。

XIAP是一种细胞内源性的抗凋亡蛋白,属于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)。而XIAP是该家族中结构最典型、作用最强、功能最全面的Caspase抑制因子。它含有三个结构域:BIR、RING和CARD,其中特征性功能结构为氨基端的3个BIR结构域:BIR1、BIR2和BIR3。XIAP主要通过BIR3结构域与Caspase-9单体相结合,形成异源性二聚体,使Caspase-9失去单体结构而丧失其催化活性,当BIR3结构域发生突变后,XIAP将会失去对Caspase-9的抑制作用。

盐酸法舒地尔是一种Rho激酶(ROCK)特异性抑制剂,起初认为其仅是一种细胞内钙离子拮抗剂,可以抑制蛋白激酶A/C/G和肌球蛋白轻链激酶,从而使血管平滑肌舒张、血管扩张[3]。脑缺血后缺血神经元轴突内ROCK蛋白表达增加、活性增强[4-6],盐酸法舒地尔不仅可以通过以上的作用机制来缓解脑缺血症状,还可以通过直接作用于受损的神经元而发挥神经元保护作用。本实验研究表明,预先给予盐酸法舒地尔不仅能延迟SE出现的时间,并且能减轻癫痫发作级别以及神经元的损伤程度;盐酸法舒地尔可能是通过上调SE大鼠脑组织XIAP的表达而抑制Caspase-9产生,从而发挥神经元保护作用。

[1] Thornberry NA,Lazebnik Y.Caspases:Enemies within[J].Science,1998,281(5381):1312-1316.

[2] Fujita E,Egashira J,Urase K,etal.Caspase-9processing by caspase-3via a feedback amplification loop in vivo[J].Cell Death Differ,2001,8(4):335-344.

[3] Masahiro T,Hiroshi N,Hideo Y,etal.Development of specific Rho-kinase inhibitors and their clinical application[J].Biochimica et Biophysica Acta,2005,1754:245-252.

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[6] Huang L,Li Q,Li H,etal.Inhibition of intracellular Ca2+release by a Rho-kinase inhibitor for the treatment of ischemic damage in primary cultured rat hippocampal neurons[J].Eur J Pharmacol,2009,602(2-3):238-244.

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