水杨酸对华北落叶松高温胁迫缓解的研究

2011-06-15杨龙丰杨秀清

河北林业科技 2011年6期

关键词：培养皿水杨酸落叶松

杨龙丰，杨秀清

（1.大同市林业建设工程质量监督站，山西大同 037038；2.山西农业大学林学系，山西太谷 030801）

水杨酸对华北落叶松高温胁迫缓解的研究

杨龙丰1，杨秀清2

（1.大同市林业建设工程质量监督站，山西大同 037038；2.山西农业大学林学系，山西太谷 030801）

以当年华北落叶松种子为实验材料，研究3种不同浓度水杨酸（SA）对华北落叶松幼苗体内SOD酶活性的影响。结果表明：用0.3mmol/L SA处理华北落叶松幼苗后，可提高其体内SOD酶活性,即可显著提高华北落叶松幼苗的抗热性，从而使华北落叶松幼苗在低海拔地区能安全度过酷热的夏季。

华北落叶松种子；水杨酸；SOD酶活性

全球环境日益恶化，温室效应加剧，增加森林覆盖率是解决这些问题的最有效途径，而提高造林成活率是造林成功中最关键的因素。在华北地区，华北落叶松是山地造林首选树种，在实践中，华北落叶松由于抗热性差，在低海拔地区难以度过酷热的夏季。本次实验旨在通过分析3个不同浓度SA对华北落叶松幼苗体内SOD酶活性的影响，确定最佳的SA浓度，用以外施提高华北落叶松幼苗的抗热性。

1 实验材料与方法

1.1 实验原理

实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。在有可氧化物的存在下，核黄素可被还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易氧化而产生O2-，O2-可将氮蓝四唑还原为蓝甲，蓝甲在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2-从而抑制了蓝甲的形成。光还原反应后，反应液蓝色愈深说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

1.2 实验材料

当年华北落叶松种子。

1.3 实验方法

（1）选种处理。从纯净的种子中随机抽取3200粒种子，先用清水冲洗，再用0.001mol/L的高锰酸钾浸泡30min。而后用蒸馏水冲洗1遍，于始温45℃的水中浸泡3d。

（2）摆放种子。发芽皿垫上滤纸，用纱布作为导水器，烧杯中加蒸馏水，即发芽床。将经过消毒浸种的种子分组放置于32个发芽床，每个发芽床上整齐的放置100粒种子，种粒之间保持一定距离，以免霉菌蔓延感染和幼根相互接触。种粒的排列应有一定的顺序。在每一发芽床上贴上标签，写明送检样品号，重复号、置床日期，以免错乱，然后将发芽器放入光照发芽箱。

（3）常温发芽。把培养皿放于SPX-G型的光照培养箱中，在（23±0.5）℃的全光照下培养14d。在此期间要每天观察发芽情况并保持滤纸湿润。

（4）水杨酸处理。于第15天将华北落叶松幼苗分别移到新的培养皿中，其中24个培养皿中分别加入0.1、0.3、0.5mmol/L的SA（水杨酸），每个浓度8个培养皿，记作处理2、3、4，另外8个培养皿中加蒸馏水，作为对照，记作处理1。将放入幼苗的培养皿放入培养柜中分别培养1～8h，温度（23±0.5）℃，光照为全光照。分别记录各处理的华北落叶松幼苗在1～8h的各个时间段的SOD活性，编号为 1-1、2-1、3-1、4-1、1-2，……4-8，前边的数字 1、2、3、4 为处理 1、2、3、4，后边的 1～8代表培养时间。

（5）高温处理。再次制作新的培养器，将SA处理过的华北落叶松幼苗再种到新的苗床上，种前用蒸馏水将苗体洗一下，然后放入培养箱，温度调到（45±0.5）℃，全光照，处理 2h，这期间保持滤纸湿润。

2 测定方法

2.1 NBT（氮蓝四唑）反应液配制

（1）配制50mMpH7.8的磷酸缓冲液240mL和 50mL （甲液：乙液 =9∶1）。甲液 ∶取Na2HPO4.12H2O 5.370g定容于300mL；乙液：取KH2PO40.34g定容于50mL。

（2）13mM甲硫氨酸。在240mL50mM的磷酸缓冲液中加入0.464g甲硫氨酸，待完全溶解后加入后面的试剂。

（3）63uM氮蓝四唑（NBT）。在30mL溶液（2）中加入0.0112gNBT。

（4）1.3mM核黄素。在溶液（3）中加入0.014mg 核黄素；（0.014g/30ml，取 100ul）。

（5）0.1mM核黄素。在溶液（4）中加入0.0088gEDTA。

将上述步骤配制的反应液避光保存。

2.2 酶液提取

剪取0.1g植物材料，置于研钵中，加入少许石英砂和1mLpH7.8磷酸缓冲液，分2次加入，在冰上研磨成匀浆；做3份重复，分别转入1.5mL离心管，12000rpm冷冻离心15min，取上清液供酶活测定。

2.3 照光实验

取34支大试管，各加入6ml反应液，从32份酶液中各取50uL分别加入32支中，摇匀。另外2支为对照，1支对照管保存于暗处，作为参比；另1支对照管和32支样管在25℃下照光约20min后，在560nm波长下比色。

3 结果计算

以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活单位。

Ack—照光对照管的吸光值，Ae—样品管的吸光值，V—酶提取液总体积，Vt—测定时所用的酶液体积，W—样品鲜重。样品酶活性单位表示：SOD酶活性单位μmol·g-1（Fw）·min-1。

4 结果与分析

4.1 对照的华北落叶松幼苗SOD酶活性变化的分析

对照的华北落叶松幼苗，SOD酶活性的变化总体呈现出小幅波动，前1～6h变化不明显，6～7h开始呈现出大幅下降趋势，第8小时时下降到最低点。

表1 在4种不同处理下华北落叶松幼苗SOD的活性变化

4.2 0.1mmol/L SA处理的华北落叶松幼苗SOD酶活性变化分析

用0.1mmol/L SA处理的华北落叶松幼苗，SOD酶活性的变化呈现出不断大幅波动的趋势。1～2h时无明显变化，2～3h迅速上升，3～4h迅速下降，4～5h再次迅速升高，5～7h又迅速下降，第8小时又大幅上升。曲线有3个高峰2个低谷，3～5h这个时间段SOD酶活性高于对照，且第3小时最高，说明第3小时为此浓度的最佳处理时间。

4.3 0.3mmol/L SA溶液处理的华北落叶松幼苗SOD酶活性变化分析

用0.3mmol/L SA溶液处理的华北落叶松幼苗，SOD酶活性的变化大致与0.1mmol/L SA溶液处理的华北落叶松幼苗SOD酶活性的变化相同，只是在1～2h时有明显的上升，其余变化趋势一致。曲线有3个高峰2个低谷，2～5h这个时间段SOD酶活性高于对照，且第5小时最高，说明第5小时为此浓度的最佳处理时间。

4.4 0.5mmol/L SA溶液处理的华北落叶松幼苗SOD酶活性变化分析

用0.5mmol/L SA溶液处理的华北落叶松幼苗，SOD酶活性的变化大致与0.1mmol/LSA溶液处理的华北落叶松幼苗SOD酶活性的变化相同，只是在1～2h时大幅度上升，2～3h时下降，其余变化趋势一致。曲线有3个高峰2个低谷，第2、3、5、6时SOD酶活性高于对照，5最高，说明第5小时为此浓度的最佳处理时间。

4.5 综合分析

SA处理过的SOD活性变化曲线的共同点是上升与下降趋势大致相同，与对照相比表现出明显的大起大落，而对照曲线变化则很平缓；前2h 4条曲线变化基本一致，但5～6h时SA处理过的SOD酶活性变化与对照变化趋势相反；5～6h时对照的SOD酶活性升高，而SA处理过的SOD酶活性反而迅速降低；7～8h时对照的SOD酶活性下降并降到最低，而SA处理过的SOD酶活性反而迅速升高，此现象表明长时间的SA处理会使华北落叶松体内的生理反应发生紊乱。从图1可以看出不同浓度的SA处理2～3h华北落叶松幼苗后，均可提高华北落叶松高温处理后SOD酶的活性，即均可提高华北落叶松的抗热性，此结果与玉米种子经SA预处理后其幼苗抗热性提高的研究一致。