张超凡，黄艳岚，周 虹，易九红

（湖南省作物研究所，湖南 长沙 410125）

简单重复序列（simple sequence repeat，SSR），又称微卫星DNA和短串联重复，可依据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳，再根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。SSR标记缺点是引物开发难度大，但由于是共显性标记，具有用量少，数量丰富、重复性好等优点[1]。目前，SSR 标记已广泛应用于水稻[2-4]、小麦[5-6]、玉米[7]、大豆[8]、油菜[9-10]等的遗传多样性分析和图谱构建。本研究利用SSR分子标记对来自湖南31份甘薯品种进行遗传多样性分析及亲缘关系鉴定，目的在于探讨湖南甘薯地方品种与育成品种之间的遗传多样性，为进一步分析湖南甘薯遗传多样性提供可靠的标记手段。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 本研究所用甘薯材料取自湖南省作物研究所，包括11份育成品种和20份地方品种（表1），均来自于湖南省。

1.1.2 试 剂 SSR引物如表2所示，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。Taq DNA聚合酶（2.5 U/mL）和DNA Marker购自天根生化有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 基因组的提取 DNA取顶部展开新鲜叶片3～4片，置已编号保鲜袋中，采用CTAB[11]法对甘薯幼嫩叶片进行基因组DNA提取。

1.2.2 SSR分析 SSR的PCR扩增体系：2μL的10×PCR Buffer，2.5 μL 的 2.0 mM dNTPs，50 ng 甘薯DNA，1U Taq酶，2μL的5 mM引物（对），加ddH2O至20μL。SSR扩增条件为：94℃预变性4min；然后进行以下35个循环：94℃变性30 s，58℃复性30s，72℃延伸1min，最后72℃充分延伸7min。PCR产物加上样缓冲液（98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA pH 8.0，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯腈）变性后自然冷却，用5%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，硝酸银染色，并拍照保存。

表1 本研究所用的品种名称

1.2.3 统计方法 胶板晾干后在灯箱上读带。统计方法参照文献[12]。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记的多态性分析

对SSR分子标记分析的12对SSR引物进行PCR扩增，引物对SSR11电泳结果如图1所示，共检测出74等位基因位点，每对引物检测出的等位基因位点3～10个，平均为6个。其中引物SSR7扩增的等位基因位点最多，为10个，引物SSR12扩增的等位基因位点最少，为3个。

表2 SSR引物组合及扩增条带

图1 SSR引物组合SSR11对31个甘薯品种的扩增结果

2.2 甘薯品种间的遗传差异

用SSR标记对31份甘薯品种进行了聚类分析，供试材料的遗传距离为0.272 7～0.626 9，平均0.520 4，表明供试材料之间遗传多样性丰富，遗传差异大。根据甘薯SSR标记分析，对供试材料进行UPGMA聚类分析（图2）。从聚类图可以看出，湘78-150与湘薯12号的遗传距离最近。

图2 基于SSR标记得到的31份甘薯品种的聚类图

2.3 甘薯地方品种与育成品种遗传差异分析

经过遗传距离计算，20份湖南地方品种遗传距离为 0.288 1～0.814 8，平均 0.524 0；11 份育成品种遗传距离为0.272 7～0.894 7，平均0.511 5。两类材料平均遗传距离大小为GDMC>GDL。湖南甘薯地方品种与湖南育成品种的遗传距离0.288 1～0.7037，平均 0.516 7。

3 讨论

分子标记技术可以不受环境、发育时期、不同器官等的限制，从基因组水平上揭示遗传变异程度。利用SSR标记进行研究时，需要知道研究材料两端的序列信息，开发有一定困难，费用也较高，使得其在甘薯遗传多样性研究中受到限制。研究利用SSR方法分析31份湖南甘薯地方品种与育成品种的遗传多样性，扩增的等位基因位点丰富。聚类图上可以看出湘薯10号与湘薯6号的亲缘关系较近；湘薯17号与湘薯86-75亲缘关系较近，这与它们的系谱图相吻合，说明SSR标记适用于检测甘薯的遗传多样性。

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