吕世琪，张金良，闫 奇

(安徽省阜阳市第五人民医院检验科，安徽 阜阳 236037)

目前临床常用ELISA法进行乙肝五项的检测和用荧光定量PCR法进行HBV-DNA的定量检测来判断HBV病毒的感染或复制情况。我们应用荧光定量PCR技术对450份血清标本在一周内进行HBV-DNA的检测，并采用ELISA法进行对照检测，结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 实验对象 450例患者血清均来自阜阳市第五人民医院2011年1月至2011年6月门诊及住院病人 ，其中男性323例，女性127例，年龄10～70岁。按乙肝五项不同模式，将HBsAg(+)/HBeAg(+)/HB-cAb(+)为第一组，HBsAg(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)为第二组，HBsAg(+)/HBcAb(+)为第三组，HBsAb(+)/HBeAb(+)/HBcAb(+)为第四组，HBcAb(+)为第五组，HBsAg(-)/HBsAb(-)/HBeAg(-)/HBeAb(-)/HBcAb(-)，乙肝五项全阴为第六组。

1.2 实验方法

1.2.1 HBV-DNA定量 分析，FQ-PCR检测HBVDNA试剂盒为中山大学达安基因股份有限公司，测定仪器 为中山大学达安基因股份有限公司的DA7600荧光定量PCR仪。 严格按试剂盒说明进行操作，采用常规的高温裂解法，从血清中提取HBV-DNA，同时做阴性、临界阳性、强阳性质控品。标准参照品均由试剂盒配置，HBV阳性定量参考品：1.0×104IU/ml/管、1.0×105IU/ml/管、1.0×106IU/ml/管、1.0×107IU/ml/管，取上清液 2μl加入 FQ-PCR 反应管，按下列条件进行扩增，93℃ 2min，然后按93℃45s～55℃ 60s 10 个循环，93℃ 30s～55℃ 45s 30 个循环。反应结果由仪器自动分析，直接由电脑得出血清标本 的乙肝病毒拷贝数。正常参考值为＜1.00×103拷贝/ml。

1.2.2 乙肝五项物采用ELISA法测定，试剂盒购自上海荣盛生物技术公司。操作严格按试剂盒说明书进行。

2 结果

乙肝五项不同组合状态血清HBV-DNA含量比较结果显示，第一组患者血清HBV-DNA阳性率为 94.9%，HBV-DNA平均含量为 4.51×107copies/ml，第二组患者血清HBV-DNA阳性率为64%，平均含量为2.42×105copies/ml，第三组患者HBV-DNA阳性率为58%，平均含量为4.25×104copies/ml，第四组HBV-DNA阳性率为5%，平均含量为5.31×103copies/ml，第五组HBV-DNA阳性率为1.2%，平均含量为1.35×103copies/ml，第六组HBV-DNA阳性率为1.1%,平均含量为8.37×103copies/ml，见表1。

表1 各组HBV-DNA阳性率及平均含量

从上表可以看出第一组与第二组第三组HBVDNA阳性率及HBV-DNA平均含量有明显差异，第四组有一例阳性患者，当时ALT：1280U/L，诊断为重性乙型肝炎，半月后复查HBV-DNA阴性，第六组一例阳性患者反复ALT升高100～180U/L，经肝细胞穿刺，原位杂交HBsAg(+)，病理诊断为乙肝。

3 讨论

3.1 FQ-PCR法是实时在线检测PCR反应过程中的荧光信号变化，避免了PCR平台效应的干扰。而且是闭管检测，无需电泳等后处理过程，从而避免了污染，减少了假阳性的可能。本实验结果第一组156乙肝标本，其中148例HBV-DNA阳性，阳性率达94.9%(148/156)，第二组75例乙肝标本，其中48例HBV-DNA阳性，阳性率达64%(48/75)第六组89例乙肝五项全部阴性的标本，HBV-DNA只有一例阳性。所以该法具有高灵敏性、高特异性及高精确性。ELISA法检测乙肝五项是临床诊断HBV感染的传统手段，但它检测的是人体对HBV的免疫反应状态，不能直接反映血清中的病毒含量。而HBV的复制水平、和治疗恢复情况等则可通过检测血清中HBV-DNA含量准确反映出来。

3.2 本研究结果显示第一组(大三阳)标本阳性率为94.9%，HBV-DNA平均含量高，说明乙肝病毒传染性强，复制高。

3.3 本实验中75例第二组 (小三阳)标本阳性率达64%(48/75)，HBV-DNA 含量达 2.42×105拷贝/ml，可能是由于这种病人是长期的乙肝病毒携带者，HBV在体内不断复制，持续遭受机体免疫力的攻击，导致HBV病毒复制减低，或者另一种情况是HBV前c区的变异[1]，影响HBeAg的表达。

3.4 1 2例第三组血清中HBsAg阳性，HBeAg转阴，HBcAb的出现说明病毒复制减低。

3.5 2 0例第四组血清阳性 率为5%(1/20)，HBVDNA含量为5.31×l03拷贝/ml，一般认为这类病人应是进人感染恢复期，少数病例仍能检出低水平的HBV-DNA，可能由于HBV病毒的基因发生突变[2]，导致HBsAg抗原性改变，使血清HBsAg(+)不能检出，这1例病人病情已经好转，HBV-DNA转阴。

3.6 9 8例第五组血清阳性率1.2%(1/98)乙肝病毒单项抗-HBc阳性者，这种情况表明血中可能与HB-cAb阳性多的情况下是免疫记忆所致，也有少部分是 HBV-DNA复制[3]。

3.7 第六组89例乙肝五项全阴的标本，有1例HBV-DNA阳性，肝细胞穿刺HBsAg(+)证实为慢乙肝可能与HBsAg表达低、含量少，不能检出有关。

FQ-PCR检测HBV-DNA含量具有简便、快速、特异性强、准确定量的优点。HBV-DNA含量能更清楚地反映乙肝患者传染性强弱。乙肝五项的检查影响因素较多，不能直接反映血清中的病毒含量，两者互补，能为临床诊断、治疗方案的选择及疗效监控提供更可靠的依据。

[1]郭 卉,董瑶佳,刘晓峰,等.乙肝血清学标志物与HBV-DNA含量关系的分析[J].实验与检验医学,2010,28(4):417-418.

[2]孙华宝,曹 立,罗娅薇,等.乙型肝炎病毒基因变异及临床相关性研究[J].实验与检验医学,2009,27(2):153-154.

[3]徐光明,贺 欣,袁水斌,等.血清乙肝五项模式与HBV-DNA水平之间关系及其临床应用[J].实验与检验医学,2009,27(6):663-664.