刘颖娜 李东至

(广州医学院附属广州市妇女儿童医疗中心产前诊断中心,广东广州 510623)

致死性骨发育不良(Thanatophoric dysp lasia,TD)是常见的致死性骨骼发育不良疾病,属常染色体显性遗传病,发生率约为活产的(0.21～0.30)/10 000[1]。主要表现为严重短肢、短指/趾、头大、前额突出、鼻梁塌陷、胸廓狭窄、小肋、腹膨隆、扁平椎及躯干长度正常等[2,3]。TD属于致死性疾病,患者大多在围产期死亡,存活者生存期很少超过6个月,死因多是由于胸腔狭窄导致的肺发育不全或枕骨大孔狭窄导致的中枢性呼吸抑制[4]。

TD患儿多在产前经超声检查发现。TD可分为2型,I型(TD I)更常见。典型超声特点为[2]:长骨显著缩短、股骨短小如“电话听筒”状、胸腔狭窄、肋骨缩短等。但仅靠超声检查不易与其他骨发育异常疾病鉴别,分子诊断有助于确诊。本文报告2例应用高分辨率熔解曲线分析技术(high-resolution melting analysis,HRM)快速产前诊断TD I。

1 临床病例报告

1.1 病例1 孕妇23岁,G1P0,妊娠20周超声检查发现:双顶径 49.2 mm,胸围113.6 mm,股骨长15.9/13.1mm,形状似“电话听筒”(图 1A)。胎儿双顶径与孕周相符,胸廓狭小、股骨短而弯曲,考虑TDI,遗传咨询后孕妇决定行羊膜腔穿刺术,抽取羊水行细胞遗传学和成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因突变检查。

1.2 病例2 孕妇30岁,G2P0,妊娠27周超声检查发现:双顶径 68.4 mm,头围249.5 mm,胸围141 mm,腹围201.5 mm,股骨长 16.1/14.2 mm,“电话听筒”特征不典型(图1B)。胎儿双顶径、头围与孕周相符,胸廓狭小、股骨短而弯曲,首先考虑TD I。遗传咨询后孕妇接受脐带血管穿刺术,取胎血行细胞遗传学和成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)基因突变检查。

图1 2例胎儿股骨的超声图像(A:病例1;B:病例2)

2 实验室检测方法

2.1 染色体核型分型 采用细胞遗传室常规的羊水细胞和脐带血淋巴细胞染色体制备技术。

2.2 HRM检测

2.2.1 DNA提取 羊水和胎血标本采用Qiagen DNA Mini kit(Qiagen,Germany)试剂盒提取DNA,按使用说明操作。

2.2.2 PCR扩增 设计引物扩增FGFR3基因第7外显子包含c.742位点的区域,引物序列分别为:正 向 5′-CCCTGAGCGTCATCTGCC-3′,反 向 5′-GCACCGCCGTCTGGTTG-3′(NCBI reference sequence NC_00000 4.10)。PCR反应总体积为10μL,包括:dNTP各 200μM、正反向引物各1.6 pM 、0.5U Taq DNA 聚合酶(Promega)、5 μL 2×GC bufferⅠ(T akaRa)、20 ng基因组DNA 模板、1μL 10×LCG reen Plus。用 LightScanner(Idaho Technology)专用的 96孔板在热循环仪(Tprofessional,biometra)上扩增模板。PCR反应条件:94℃预变性 3分钟;随后94℃变性 20 s,65℃退火20 s,72℃延伸20 s,共40个循环;最后94℃30 s,25℃30 s形成异源双链。PCR扩增产物片段长度为85 bp。

2.2.3 HRM分析 PCR扩增完成后,将96孔板移至LightScanner(Idaho Technology)进行熔解曲线分析。LightScanner温度范围设置为70～98℃,温度变化速度0.1℃/s。持续监测荧光变化,采集数据,获得熔解曲线,整个过程大概5分钟。应用LightScanner Softwarewith Call-IT 2.0软件分析数据。整个PCR反应和HRM分析过程不超过2个小时。

2.3 DNA序列测定 对H RM分析阳性样本进行DNA测序验证,PCR扩增产物委托上海英骏生物技术有限公司测序分析。

3 结果

3.1 病例1 羊水细胞核型分型结果正常(46,XX),H RM检测FGFR3基因第7外显子示为c.742C＞T(p.R248C)杂合突变,其HRM 熔解曲线与c.742C＞T杂合突变阳性对照样本的熔解曲线集成一簇,与野生型明显区分开(图2A)。结果被基因测序证实(图3A)。

图2 FGFR3基因第7外显子的HRM Difference Curves分析结果,

3.2 病例 2 脐血细胞核型分型结果正常(46,XY),HRM分析FGFR3基因第7外显子显示存在碱基变异,但非c.742C＞T突变,其HRM 熔解曲线与c.742C＞T杂合突变阳性对照样本和野生型样本的熔解曲线都明显区分开(图2B)。推测其为第7外显子上另一种较常见的c.746 C＞G(p.S249C)杂合突变。结果被基因测序证实(图3A)。

图3 FGFR3基因第7外显子测序结果

4 讨论

既往研究已证实FGFR3基因的突变与致死性骨发育不良I型的发生密切相关。成纤维细胞生长因子受体3(fibroblast grow th factor receptor s3,FGFR3)属酪氨酸激酶受体家族,是一种发育调节跨膜受体。人类FGFR3基因位于4p16.3,包括19个外显子和18个内含子,共16.5 kb,FGFR3蛋白由3个细胞外免疫球蛋白样的FGF结合域(IgⅠ,IgⅡ,IgⅢ)、跨膜区(TM)和2个胞内酪氨酸激酶区(TK 1和TK 2)组成。人类FGFR3基因的突变会引起一系列骨骼发育缺陷性疾病,如软骨发育不全(achond roplasia,ACH)、软骨发育低下(hypochond rop lasia,HCH)和 TD等。TDⅠ患者中已发现多种不同的点突变类型,大多数为单个氨基酸突变成Cys,突变分部于FGFR3基因3种不同的结构域,主要集中在IgⅡ和IgⅢ结构域的连接区(A rg248Cys和 Ser249Cys)、近膜区(Gly370Cys、Ser371Cys和Tyr373Cys)和羧基端(stop807Gly、stop807Cys和 stop807A rg)[5]。其中,73%的TDⅠ是由p.R248C、p.S249C和 p.Y373C 3种错义突变所致[6]。

本研究对2例超声发现疑为TDI的胎儿进行快速诊断,采用HRM技术检测FGFR3基因第7外显子p.248突变热区。病例1羊水样本的H RM熔解曲线与p.R248C阳性对照样本一致,诊断为TD I;病例2脐血样本的H RM熔解曲线与野生型和p.R248C阳性对照样本的熔解曲线均不同,考虑该患儿FGFR3基因第7外显子存在突变,但并非最常见的 p.R248C,可能为该区域另一常见突变 p.S249C。直接测序检测FGFR3基因第7外显子,证实为p.S249C杂合突变。在以前的研究中我们报告了中国人TD I病例几乎均为p.R248C突变[7],此例p.S249C突变为国内首次报道,也进一步证实了HRM是一种快速、简便、高敏感性和高特异性的分子诊断方法。

对产前超声检查疑为 TD I的病例,产前取材排除染色体疾病的同时应行基因检查。应用H RM分析法基因检测FGFR3基因的常见突变,可快速明确诊断,产前取材后24小时内即可得出诊断报告。确诊者在临床可及时终止妊娠,减轻孕妇等待结果的精神压力和晚期引产的不良影响,并有助于疾病再发风险的遗传咨询。

[1]Waller DK,Correa A,Tuan MVO,et al.The Population-Based Prevalence of Achond roplasia and Thanatophoric Dysp lasia in Selected Regions of the US[J].Am erican Journalof MedicalGenetics Part A,2008,146A:2385-2389.

[2]Sch ramm T,G loning KP,Minderer S,et al.Prenatal sonographic diagnosis of skeletal dysplasias[J].Ultrasound Obstet Gynecol,2009,34:160-170.

[3]Martinez-FriasM L,Frutos CA,Bermejo E,et al.Review of the recen tly defined molecular mechanisms underlying thanatophoric dy splasia and their potential therapeutic implications for achond rop lasia[J].Am JM ed Genet Part A,2010,152A:245-255.

[4]Baker KM,Olson DS,Harding CO,et al.Long term su rvival in typical thanatophoric dysplasia type 1[J].Am J M ed Genet,1997,70:427-436.

[5]Zoltan VAJO,Clair A,Francomano,et al.Themolecu lar and genetic basis of fib roblast grow th factor recepto r 3 disorders:the achondroplasia family of skeletal dysplasias,muenke craniosynostosis,and crouzon synd rome with acanthosis nigricans[J].Endocrine Review s,2000,1:23-39.

[6]Rousseau F,El Ghouzzi V,Delezoide A L,et al.Missense FGFR3 mu tations create cysteine residues in thanatophoric dwarfism type I(TD1)[J].Hum Molec Genet,1996,5:509-512.

[7]Yang Y,Li DZ.FGFR3 genemu tations in Chinese cases of thanatophoric dysp lasia type 1[J].Fetal Diagn Ther,2009,26:90-92.