韩懿岚，王思明，李晓峰，董 玫，路新华，3，史清文，丛 斌，谷建平

(河北医科大学1.法医学系，2.药学院，天然药物化学教研室，河北石家庄 050017;3.华北制药集团新药研究开发有限责任公司微生物药物国家工程研究中心，河北石家庄 050015)

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤之一，占全部脑肿瘤的45% ～55%。目前，包括手术、放射治疗和综合治疗等主要治疗措施已取得长足进步，但由于胶质瘤浸润性生长，与周围脑组织无明显分界且易于复发，其疗效均不甚理想，因此，从植物和微生物中寻找高效抗癌的新化合物和新作用靶点已成为国际新药研发的热点。山酮(Xanthones)是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基的植物型多酚，具有抗疟、抗癌、抗氧化和抗炎等活性［1］。本研究首次检测了3种山酮类化合物抑制人脑肿瘤细胞增殖的效应，并进一步选取与细胞凋亡相关的蛋白p53和Bax为研究对象，探讨山酮类化合物诱导人脑肿瘤细胞增殖的分子生物学机制，为研发新的抗肿瘤药物及临床应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1药品和试剂从微生物次生代谢产物中纯化的3种山酮类化合物1'-hydroxy Austocystin D(1)［2］、Austocystin D(2)［3］和 Austocystin H(3)［3］由华北制药集团新药研究开发有限责任公司提供，经HPLC和1H-NMR检查，纯度在99%以上(Fig 1)。噻唑蓝(MTT，美国 Sigma公司，M-2128);RPMI 1640培养基(美国，Gibco);顺铂(美国 Sigma，034k3693);质粒p53报告基因(pG53-Luc)、Bax报告基因(pGBax-Luc)和内参照基因(SV-40-Rluc)由日本千叶大学医学部第一生物化学研究室提供。

Fig 1 Chemical structures of 1'-hydroxy Austocystin D，Austocystin D and Austocystin H

1.2细胞系人原发性脑肿瘤细胞(T-98和U251SP)和继发性脑肿瘤细胞(KT)由日本千叶大学医学部第二生物化学研究室提供。各细胞接种于直径为100 mm的培养皿中，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，37℃和5%CO2培养箱中培养。

1.3实验方法

1.3.1MTT法［4］将3种人脑肿瘤细胞悬浮接种于96孔板，每孔90 μl(含1×104个细胞)，分别加入溶剂对照(终浓度0.1%DMSO)、阳性对照顺铂和终浓度为100、10 和1 μmol·L-1的3 种山酮化合物各10 μl，每组均设3复孔，置于饱和湿度、37℃和5%CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h，各培养孔加入5 g·L-1的MTT 10 μl，用酶联免疫检测仪测定各孔吸光度值(OD值)，并计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率/%=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。实验数据用Origin 7.0软件进行处理，受试药物对细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合，计算药物的IC50值。

1.3.2荧光素酶报告基因检测［5］KT细胞以每孔5×104个细胞接种于24孔板中，用含10%FBS的RPMI 1640培养液培养细胞24 h，弃去培养液，用PBS洗细胞两次。取500 ng荧光素酶报告基因质粒pG13-Luc和pGBax-Luc以及5 ng内参照基因质粒SV-40-Rluc与1.2 μg脂质体共同加入0.6 ml无血清的RPMI 1640培养液中，混匀室温孵育30 min后转入培养孔中。于37℃和5%CO2培养箱中培养3 h。弃去转染液，更换含有终浓度为5 μmol·L-1的阳性对照顺铂和Austocystin H的10%FBS的RPMI 1640培养液培养细胞24 h后，弃去培养液，用1×PLB(passive lysis buffer)裂解细胞后，立即上机检测，记录报告基因pG53-Luc和pGBax-Luc荧光素酶与内参照基因SV-40-Rluc荧光素酶活性的比值。

1.3.3Western blot检测［7］取对数生长期细胞，按2×106个细胞/培养皿接种KT细胞。加入含有终浓度为5 μmol·L-1的阳性对照顺铂和Austocystin H的培养基培养细胞24 h，离心收集细胞，用PBS洗涤细胞后，加入上样缓冲液100 μl，剧烈震荡后冰浴下超声波处理1 min。100℃加热3 min使蛋白质变性，15 000 r·min-1离心15 min，取上清液测定蛋白浓度。取50 μg蛋白在SDS-PAGE电泳下分离，分离胶为12%，浓缩胶为5%。根据预染的蛋白Marker指示，小心割取GR所在的区带，电转移至硝酸纤维膜，用5%脱脂奶粉于室温下摇动封闭膜1 h。膜在抗p53多克隆抗体(1∶1 000)和抗Bax多克隆抗体(1∶1 000)稀释液中室温过夜，1×TBS-T洗膜15 min，共3次后，在二抗稀释液(抗鼠1∶20 000)中孵育20 min。再次洗膜后加入ECL试剂，反应5 min，用X线曝光1～10 min后，显影。

1.4统计学处理数据用±s表示。两组间数据用t检验。应用The SAS system 6.12统计软件分析。

2 结果

2.13种山酮类化合物对人脑肿瘤细胞增殖的影响结果如Fig 2所示，阳性对照顺铂对3种人脑肿瘤细胞的增殖显示中等程度的抑制活性，IC50分别为 11.26、12.38 和 34.67 μmol·L-1;Austocystin H对T-98和U251SP细胞的增殖显示与阳性对照顺铂相近的抑制活性，但对KT细胞的增殖显示极强的抑制活性，10和100 μmol·L-1剂量组与空白对照相比差异均有显著性，呈剂量依赖性，IC50仅为0.69 μmol·L-1;1'-hydroxy Austocystin D 和Austocystin D对3种人脑肿瘤细胞的增殖均不显示抑制活性，IC50均大于 100 μmol·L-1。

2.2Austocystin H对KT细胞内p53和Bax报告基因表达的影响使用5 μmol·L-1的顺铂和Austocystin H处理KT细胞后，观察其对KT细胞报告基因表达的影响，结果显示，5 μmol·L-1的阳性对照顺铂可诱导KT细胞内p53和Bax报告基因的表达(P＜0.01)，分别为空白对照的2.94倍和4.66倍;5 μmol·L-1的 Austocystin H 可使 KT细胞内Bax报告基因增强(P＜0.01)，为空白对照的5.61倍(Fig 3A)。

2.3Austocystin H对KT细胞内p53和Bax蛋白的上调作用为了进一步探讨Austocystin H对KT细胞内p53和Bax蛋白的影响，使用5 μmol·L-1的顺铂和Austocystin H处理KT细胞24 h后，通过Western blot方法检测细胞内p53和Bax蛋白的变化。实验结果如Fig 3B所示，Austocystin H作用KT细胞后，可上调KT细胞内的p53和Bax蛋白表达。

3 讨论

目前癌症的化学治疗已取得很大进步，但是由于脑部存在血脑屏障的特殊结构，脑肿瘤的化学治疗仍受到许多限制，而且化疗药物只能通过药物的脂溶性通过血管内膜，进入肿瘤细胞产生作用，这样的模式影响了药物作用的速度与效率，而且在传统的全身系统化学治疗中，药物剂量较大，但肿瘤局部药物浓度较低，易造成严重的肝脏损害及骨髓抑制，往往由于抗肿瘤药物的毒副反应较重而不得不放弃化学治疗［6］。

本实验首次选用从微生物次生代谢产物中纯化的3种山酮类化合物1'-hydroxy Austocystin D，Austocystin D和Austocystin H为实验对象，观察了3种山酮类化合物对脑胶质瘤细胞增殖的抑制活性。结果显示，Austocystin H对T-98和U251SP细胞的增殖与阳性对照顺铂有相近的抑制活性，但对KT细胞的增殖有极强的抑制活性。

Fig 2 The effect of three xanthones for experiment on the proliferation of glioma cell lines

Fig 3 The molecular mechanism of Austocystin H on KT cells

报告基因是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因。把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因，或与其它目的基因融合，在调控序列控制下进行表达，通过报告基因的表达产物来标定目的基因的表达状况。由于报告基因技术具有灵敏度高和检测方便等特点，已被广泛的应用在药物筛选等领域［7］。本实验利用双荧光素酶报告基因检测方法，观察了Austocystin H对与细胞凋亡有关的报告基因的表达。实验结果显示，Austocystin H可使KT细胞内Bax报告基因增强，进一步的实验研究发现，Austocystin H可诱导KT细胞内的p53和Bax蛋白表达上调。根据以上实验结果，我们推测Austocystin H引起KT细胞p53表达水平的增加，p53与Bax启动子中p53的结合位点结合，从而上调Bax的表达水平，因此最终启动下游凋亡因子，而导致KT细胞凋亡。

由于促使肿瘤细胞发生凋亡是多途径共同作用的结果，因此Austocystin H诱导人脑胶质瘤细胞凋亡的分子机制还需要进一步研究，从而为开发新的抗人脑胶质瘤药物及临床应用提供一定的理论依据。

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