于冉冉，乔 伟，梁瑜祯，冯乐平*

(1桂林医学院，广西桂林541004;2广西医科大学第一附属医院)

胰岛素抵抗及β细胞凋亡均与胰岛素信号传导障碍有关。近年研究显示，胰岛素受体底物(IRS)-1和IRS-2是胰岛素信号转导途径中的重要活性蛋白，其介导的信号途径是胰岛素发挥生物学作用的必要条件［1］，其中IRS-2可调控β细胞生长、调节胰岛素分泌［2］。罗格列酮(噻唑烷二酮类药物)可影响IRS-2表达［3］，但葡萄糖浓度对其影响的研究较少。2010年5月～2011年4月，我们观察了不同浓度葡萄糖条件下罗格列酮对胰岛β细胞株NIT-1增殖、胰岛素分泌水平及IRS2表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 NOD鼠胰岛β细胞株NIT-1(华中科技大学同济医学院馈赠);RPMI1640培养基，10%FBS，无水葡萄糖粉，胰岛素放射免疫分析药盒，鼠尾胶原，二甲基亚砜(DMSO)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)。

1.2 NIT-1细胞分组与处理 将NIT-1细胞置RPMI1640培养液(含11.1 mmol/L葡萄糖、10%FBS、100 U/L青霉素、100mg/L链霉素)中，至对数生长期后以胰酶消化离心、收集细胞，按5×104个细胞/孔移至24孔培养板，继续培养48 h后分别用葡萄糖浓度为 5.6、11.1、16.7、22.2、27.6 mmol/L 的RPMI1640培养基处理(每组5个复孔)，24 h后随机分为对照组、罗格列酮1～3组，分别加入浓度为0、10-7、10-6、10-5mol/L 的罗格列酮培养。

1.3 NIT-1细胞增殖活性、胰岛素分泌水平及IRS-2蛋白表达检测 ①细胞增殖活性:采用MTT法。取1.2各组细胞，用含20%FBS的培养液配成单个细胞悬液，以5 000个/孔接种到96孔板(每孔体积200 μl)，培养48 h后每孔加MTT溶液，孵育4 h终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加150 μl DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(OD值)。②胰岛素分泌水平:取1.2各组细胞，分别于培养24、48 h后收集细胞上清液，用放射免疫分析方法按试剂盒操作说明检测胰岛素水平。③IRS-2表达:采用Western blot法。细胞至对数生长期后，分别按上述对照组、罗格列酮3组处理方法培养，24 h后提取细胞蛋白;制备SDS-PAGE胶，将蛋白样品经过变性、电泳、转膜和封闭后向PVDF膜上加入抗体孵育，然后用TBST洗涤PVDF膜，在膜上加入Ecl发光显示液，X线片曝光、显影和定影。用一维凝胶电泳分析软件对X线片显影的IRS-2蛋白条带进行Western blot半定量分析，相对表达值=待测定蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计学软件进行统计学处理。计量资料以±s表示、行方差分析，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 NIT-1细胞增殖活性 罗格列酮2组和3组细胞增殖活性均显著高于对照组，各组细胞增殖活性在葡萄糖浓度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L，见表1。

表1 不同葡萄糖浓度下四组NIT-1细胞增殖活性(n=5，OD 值，±s)

表1 不同葡萄糖浓度下四组NIT-1细胞增殖活性(n=5，OD 值，±s)

注:与对照组比较，*P＜0.01

葡萄糖浓度(mmol/L) 罗格列酮1组 罗格列酮2组 罗格列酮3组 对照组5.6 0.166±0.023 0.216±0.023*0.212±0.014*0.128±0.002 11.1 0.217±0.032 0.233±0.016*0.229±0.018*0.212±0.025 16.7 0.175±0.049 0.218±0.034*0.233±0.027*0.162±0.012 22.5 0.144±0.032 0.185±0.045*0.193±0.015*0.131±0.014 27.6 0.132±0.081 0.174±0.076*0.188±0.026*0.119±0.035

2.2 NIT-1细胞胰岛素分泌水平 不同葡萄糖浓度下四组细胞胰岛素分泌水平见表2。在各组同一时间点，胰岛素水平在葡萄糖浓度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L ＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L＞5.6 mmol/L。

表2 不同葡萄糖浓度下四组细胞胰岛素分泌水平(n=5，mIU/L，±s)

表2 不同葡萄糖浓度下四组细胞胰岛素分泌水平(n=5，mIU/L，±s)

注:与对照组及葡萄糖浓度为11.1 mmol/L比较，#P＜0.05，*P＜0.01

葡萄糖浓度(mmol/L) 罗格列酮1组 罗格列酮2组 罗格列酮3组 对照组5.6 24 h 147.12±49.22* 174.34±23.18* 164.56±27.54* 112.21±20.35 48 h 283.18±31.61* 218.23±67.37* 255.54±43.62* 123.21±34.28 11.1 24 h 273.53±58.12 320.52±64.23 302.52±59.73 231.43±34.45 48 h 302.30±57.83 318.47±87.34 364.18±84.88 267.89±79.55 16.7 24 h 248.53±29.24# 259.87±58.14# 273.10±47.32 200.45±55.22 48 h 253.84±75.23 283.38±28.84 314.12±73.62 237.12±36.66 22.5 24 h 222.75±65.24* 241.75±66.84* 232.24±68.13* 165.57±13.43 48 h 253.13±61.46 242.14±45.77 312.52±112.03* 212.22±45.77*27.6 24 h 179.56±45.52* 207.84±27.66* 218.58±25.68* 121.33±25.77 48 h 183.44±65.83# 225.62±74.77* 282.55±77.43*148.34±65.30

2.3 NIT-1细胞中IRS-2表达 不同葡萄糖浓度下罗格列酮3组IRS-2表达水平均显著高于对照组，且前者IRS-2表达水平在葡萄糖浓度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L＞22.5 mmol/L＞5.6 mmol/L＞27.6 mmol/L，见表3。

表3 不同葡萄糖浓度下罗格列酮3组和对照组IRS-2表达比较(n=5，±s)

表3 不同葡萄糖浓度下罗格列酮3组和对照组IRS-2表达比较(n=5，±s)

注:与同一葡萄糖浓度对照组比较，*P＜0.01;除#标注的两种浓度外，余三种浓度两两比较，P均＜0.05

葡萄糖浓度(mmol/L) 罗格列酮3组 对照组5.6 4.16±0.52*#2.27±0.34 11.1 6.63±0.89* 2.94±0.85 16.7 4.68±0.86* 2.31±0.58 22.5 2.83±0.34*# 0.42±0.17 27.6 2.66±0.23*0.41±0.68

3 讨论

长期髙糖毒性将导致胰岛β细胞增殖减弱、胰岛素分泌减少和细胞凋亡增多。以往文献报道，罗格列酮对不同细胞的增殖有不同影响，在肿瘤细胞中可作为过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)配体从多个方面抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，如上调 p53基因表达、降低 BCL-2表达和激活Caspase-3、Caspase-8 等［4］;但其对胰岛 β 细胞的生理作用则众说纷纭［5，6］。本研究显示，四组细胞增殖活性及胰岛素分泌水平均在葡萄糖浓度11.1 mmol/L＞16.7 mmol/L ＞22.5 mmol/L ＞27.6 mmol/L，其中罗格列酮1～3组细胞增殖活性和胰岛素分泌量均显著高于对照组。提示罗格列酮除可改善胰岛素抵抗外，尚可明显增强NIT-1细胞的增殖和胰岛素分泌功能。本研究还显示，罗格列酮3组在葡萄糖浓度为22.5、27.6 mmol/L培养24 h及葡萄糖浓度为16.7 mmol/L培养48 h时胰岛素分泌水平均显著高于对照组。提示罗格列酮能够在高浓度葡萄糖情况下抑制NIT-1细胞凋亡。

关于罗格列酮抑制高浓度葡萄糖条件下胰岛β细胞凋亡的机制目前尚不完全清楚。有学者认为可能与激活INS/PI3K/PKB(Akt)途径和调节下游信号蛋白表达有关。推测PPARγ受体激动剂除可通过PI3K/AKT信号通路减轻胰岛素抵抗外，尚可调节胰岛细胞增殖和凋亡。有关PPARγ激动剂的研究认为，罗格列酮可通过上调IRS-2表达增强胰岛素敏感性［7］、恢复胰岛素信号传递及细胞正常分化。本研究显示，在不同浓度葡萄糖培养条件下，罗格列酮3组细胞中IRS-2水平均显著高于对照组，且其随葡萄糖浓度变化的趋势与细胞增殖活性、胰岛素分泌水平基本一致。提示罗格列酮保护胰岛β细胞生长和功能的作用与促进IRS-2表达密切相关;机制可能为通过上调细胞PDX-1、NKX6.1、葡萄糖激酶和葡萄糖转运子2表达［8］增加胰岛素分泌、激活INS/PI3K/Akt通路。

综上所述，高浓度葡萄糖条件下罗格列酮可促进NIT-1细胞增殖、胰岛素分泌，机制可能与上调IRS-2表达有关。

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