刘桂红，章龙珍 ，刘美艳 ，赵 丽

(1徐州医学院附属医院，江苏徐州 221006;2徐州医学院肿瘤放射治疗教研室;3徐州医学院第三附属医院;4连云港市第四人民医院)

选择有效的目的基因是肿瘤基因治疗的关键。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TNF-TRAIL)是TNF家族近年来新发现的凋亡分子之一，能诱导多种肿瘤细胞凋亡，且其凋亡通路不依赖 p53基因是否突变，对放化疗抗拒肿瘤细胞仍然具有杀伤作用，成为目前研究热点。如何调控转移基因的体内表达被认为是基因治疗的关键技术之一。目前在肿瘤基因治疗中往往采用启动子调控体内转移基因的表达，Egr-1基因启动子序列中的放射敏感性 CArG盒可感受体内外理化刺激，诱导 Egr-1基因表达，从而对与之相连的外源基因实现双向性调控作用[1]。2010年，我们采用 Egr-1作为基因启动子，经放射线诱导调控 Trail基因在 U251人胶质瘤细胞内表达，并观察了 Trail基因表达量与放射剂量及放射时间的关系，旨在为胶质瘤细胞的基因治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 携带重组腺病毒(Ad-Egr-hTrail)的 293包装细胞(上海交通大学医学院生物化学实验室葛胜芳博士惠赠，-70℃冰箱保存)，U251人胶质瘤细胞株 (中科院上海细胞生物研究所)。高糖DMEM培养基(GIBCO公司);小牛血清(Hyclone公司);胎牛血清(PAA公司);Trizol(Invitrogen公司);细胞总 RNA抽提试剂盒，cDNA第一链合成试剂盒，PCR反应试剂盒(Fermentas公司);Pronase(Roche公司);M-MLV逆转录酶(Promega公司);dNTPmixture(Invitrogen公司);T4DNA连接酶和无DNA酶的 RNA酶(NEB公司);琼脂糖(Promega公司);100 bp Marker(天为时代公司);sybr green 1(ABgene公司);Trail引物序列(primer premier 5软件设计、上海生物工程公司合成)。

1.2 实验方法

1.2.1 Ad-Egr-hTrail载体构建扩增及鉴定 取携带 Ad-Egr-hTrail的 293包装细胞 -70℃/37℃反复冻融 3次，以裂解细胞，释放重组病毒。将上述细胞裂解液移至离心管中，12 000 r/min、离心 10 min。吸取含病毒的上清液感染 AE25crma细胞，大量扩增 Ad-Egr-hTrail行纯化及测定滴度[1]。裂解腺病毒，提取重组病毒基因组 DNA[2]，以 Ad-Egr-hTrail DNA为模板，加入引物 P1和 P2于 PCR反应体系，进行 PCR反应。反应条件:95℃、5 min，94℃、1 min，60 ℃、1 min，72 ℃、90 s;72 ℃延伸 10 min，共30个循环。结果如期扩增出 1 037 bp的 hTrail片段，表明 hTrail全长已被成功插入到腺病毒基因中。

1.2.2 Ad-Egr-hTrail转染 U251细胞 将 U251脑胶质瘤细胞按 1×105/孔接种于 6孔板，每组 3个复孔，培养至 70%～80%融合时，更换细胞培养液为血清培养液，将 Ad-Egr-hTrail以 MOI=100感染U251细胞;同时设空白对照组。

1.2.3 辐射诱导及 Trail mRNA表达检测 ①照射时间效应观察:U251细胞感染后 48 h予 X射线 2 Gy照射 。于照射前 (0 h)和照射后 2、4、8、12 h收获细胞，提取总 RNA，用 M-MLV逆转录酶进行逆转录。②照射剂量效应观察:U251细胞感染后 48 h，分别予 0、2、4、6、8、12、15 Gy X射线照射。照射后 4 h收获细胞，提取总 RNA，用 M-MLV逆转录酶进行逆转录。取每组样本的模板 cDNA反应液进行 PCR反应，每组 3个复管。加入靶基因 Trail引物 P3和P4或管家基因 GAPDH上下游引物于反应体系，每个样品的GAPDH和Trail分管同板相同条件下于荧光定量 PCR仪上检测 Trail相对表达水平(即实验组目的基因表达相对于空白对照组的变化倍数)。

2 结果

2.1 U251细胞 Trail mRNA表达的照射时间效应照射后 1 h表达水平即开始增加，4～8 h维持在一较高表达水平，照射后 4 h表达水平最高，随后开始下降。见图1。

2.2 U251细胞 Trail mRNA表达的照射剂量效应随放疗剂量增加，Trail mRNA表达水平明显增加，12 Gy时达到最高水平;随放疗剂量增加，表达水平开始下降。见图2。

图1 U 251细胞Trail mRNA表达的照射时间效应

图2 U 251细胞Trail mRNA表达的照射剂量效应

3 讨论

脑胶质瘤是最常见的原发性脑瘤，其治疗以手术、放疗、化疗为主。由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，手术难以彻底切除，而且胶质瘤细胞对常规放疗及化疗诱导凋亡敏感性低，常规治疗在杀死肿瘤细胞的同时，也会损伤正常的组织细胞，从而引起严重的毒副作用。

肿瘤基因—放射治疗为解决这一难题开辟了新的治疗途径与方法，其原理是将辐射诱导性基因的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联，转染肿瘤细胞，在对肿瘤实施局部照射时诱导基因表达，通过射线与基因的双重作用杀伤肿瘤，以达到降低照射剂量、减轻或缓解正常组织损伤和增强放射治疗效果的目的。研究发现，Trail联合辐射对肿瘤细胞有协同杀伤作用，增加胶质瘤细胞对放射线和化疗药物的敏感性[4，5]。已有研究表明，Egr-1基因启动子可用于调控多种下游基因在肿瘤细胞内表达，且表达规律与目的基因及细胞株有一定相关性。但射线诱导Egr-1调控 Trail基因表达的文献报道不多，将此方法用于治疗脑胶质瘤尚未见报道。本研究选择人源性的 Trail基因作为治疗基因，利用 Egr-1启动子的辐射诱导特性，构建辐射诱导表达腺病毒重组载体Ad-Egr-hTrail，体外将 Ad-Egr-hTrail转染 U251人胶质瘤细胞株，从转录水平研究其辐射诱导表达规律。

本实验结果显示经 X射线后 Egr-1启动子调控Trail基因的表达活性基本呈时间剂量依赖性，辐射剂量为 2 Gy时即能激活启动子调控下游 Trail基因的表达，照射后 4 h其表达水平最高;随着放疗剂量增加，下游基因 Trail的表达量明显增加，在 12 Gy时启动子活性最强，随着放疗剂量增加，下游基因Trail的表达量有所下降，推测其原因可能为过高辐射剂量导致基因结构改变，使得 Egr-1启动子活性下降，但具体机制尚需进一步研究。

总之，本研究证实 Egr-1启动子诱导下游基因Trail的表达具有时间剂量依赖性，由于辐射束具有靶向性和可控性，借助日趋完善的三维立体照射技术，将射线束准确地照射肿瘤组织，并有效地控制肿瘤组织与正常组织的照射剂量，在降低正常组织损伤的同时，实现对目的基因肿瘤局限性表达的时空调控，本研究为肿瘤的综合治疗提供了新思路。

[1]杜平，戚中田，潘卫.分子病毒学原理与实验技术[M].上海:第二军医大学出版社，2002:212-216.

[2]Zhang WW，Fang X，Branch CD，et al.Generation and identification of recombinant adenovirus by liposome2mediated transfection and PCRanalysis[J].Biotechniques，1993，15(5):868-872.

[3]徐梓榕，尹梅祥，梁显球.磁共振临床应用[M].广州:广东科学技术出版社，2002:24.

[4]Hori T，Kondo T，Kanamori M，et al.Ionizing radiation enhances tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis through up-regulations of death receptor 4(DR4)and death receptor 5(DR5)in human osteosarcomacells[J].J Orthop Res，2010，28(6):739-745.

[5]Tsurushima H，Yuan X，Dillehay LE，et al.Radioresponsive tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)gene therapy for malignant brain tumors[J].Cancer Gene Ther，2007，14(8):706-716.