郑培实，张 阳，蒋 葵，李英华，徐丽叶，方立萍，丁晓蕾

(大连医科大学附属第二医院，辽宁大连 116023)

目前，对于晚期肝癌仍缺少有效的药物治疗方案[1]，以细胞信号传导为理论基础的靶向治疗是近期研究热点。研究证实，索拉非尼诱导肝癌细胞凋亡的机制之一是通过 RAF/MEK/ERK通路[2]，而华蟾素通过 FAS通路起到抗肿瘤作用[3]。但目前疗效欠佳，其根本原因在于信号通路的交叉[4]。解决方案为发现不同通路的结点(即 Crosstalk)[5]和可能存在的信号增益。以此为理论基础即可实现不同靶点药物的合理联合，又有可能深化信号传导网络的认识，并发现更多可以利用的结点。2009年 10月 ～2010年 4月，我们将索拉非尼联合华蟾素作用于人肝癌 SMMC-7721细胞，探讨两药联合潜在的协同作用。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 人肝癌 SMMC-7721细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。华蟾素注射剂，索拉非尼。Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒。Mcl-1单克隆抗体，Tubulin多克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG和羊抗兔 IgG，PVDF膜。RPMI1640培养液(含 10%胎牛血清、青链霉素各100 U/ml)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 取人肝癌 SMMC-7721细胞，于37℃、5%CO2孵箱培养，细胞为上皮样贴壁细胞，每 3 d传代 1次。取对数生长期细胞用于试验。

1.2.2 细胞干预及相关指标检测 将对数生长期SMMC-7721细胞接种于 96孔板，密度为 7×103/孔，培养 24 h后分成四组，索拉非尼组予索拉非尼6.0μmol/L干预，华蟾素组予华蟾素 0.6μmol/L干预，联合组予索拉非尼和华蟾素联合干预(剂量同前)，对照组不做任何干预。各组均设 5个复孔，加药分别培养 24、48 h后行以下指标检测:①细胞增殖抑制率:各孔加 5%四氮唑蓝液 10μl，孵育 4 h，洗涤后各孔加二甲基亚砜 200μl，充分混匀溶解，酶标仪测定波长 570 nm处的 D值，计算细胞增殖抑制率。抑制率(%)=(对照组 D值 -实验组 D值)/对照组 D值 ×100%。②细胞凋亡率:离心去培养基，PBS洗涤后，采用 Annexin.V/PI双标记的流式细胞术避光室温标记30 min，流式细胞仪检测。③Mcl-1 mRNA:加药培养 48 h后收集细胞，提取细胞总 RNA，采用 RT-PCR法检测。于 Light Cycler RT-PCR System仪上行定量 RT-PCR;结果以 Mcl-1拷贝数/GAPDH拷贝数计算 Mcl-1 mRNA的表达。④Mcl-1蛋白:加药培养 48 h后收集细胞提取总蛋白，采用 Western blot法检测。结果用 Leica Qwin图像分析软件进行条带光密度积分值分析。

1.3 统计学方法 采用 SPSS11.5统计软件。计量资料以±s表示。两组间比较采用 F检验，多组间比较采用单因素方差分析;交互效应分析采用因子分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞增殖抑制率 各组不同时间细胞增殖抑制率比较见表1。

表1 各组不同时间细胞增殖抑制率(%)

2.2 细胞凋亡率 华蟾素组 24、48 h后凋亡率分别为 3.27%、4.35%;索拉非尼组分别为 12.31%、4.62%;联合组分别为 19.01%、7.33%，联合组与单药组比较明显升高(P均 ＜0.05)。

2.3 Mcl-1 mRNA及蛋白表达 见表2。

表2 各组 Mcl-1 mRNA及蛋白表达(%)

3 讨论

晚期肝癌缺少有效的治疗手段，利用 RAF/MEK/ERK通路[5]或FAS通路[6]以促进肿瘤细胞凋亡是目前研究热点。索拉非尼是第一个口服的多激酶抑制剂，作用机制之一即在于激活 RAF/MEK/ERK通路[6，7]。已有多项研究证实华蟾素对离体肝癌细胞具有抑制增殖和诱导凋亡作用，且其作用机制在于激活 FAS通路[8，9]。本研究结果表明索拉非尼单药、华蟾素的单药和联合均能抑制 SMMC-7721细胞增殖，诱导其凋亡。统计学分析显示两药联合有交互效应，且为协同作用。这一结果提示索拉非尼与华蟾素联用，可能取得较两药单用更好的疗效。

为进一步阐明这种协同作用的分子机制，我们检测了两种药物单独作用及联合作用情况下对Mcl-1蛋白及 mRNA表达的影响。结果表明联合组的 Mcl-1蛋白表达水平最低;索拉菲尼使 Mcl-1 mRNA和蛋白表达均显著下调，而华蟾素仅使 Mcl-1蛋白表达显著降低，提示上述协同作用可能在于索拉菲尼放大了华蟾素作用下的 FAS通路的信号，而非相反。值得注意的是，尽管没有统计学差异，但索拉菲尼下调 Mcl-1蛋白的程度确实大于华蟾素，说明索拉菲尼很可能发挥着独立于 RAF/MEK/ERK通路的、引起了 Mcl-1蛋白降解增加的作用。鉴于已经证实的 Mcl-1蛋白的降解分子通路[10]，可印证索拉菲尼对于肝癌 SMMC-7721细胞的这一潜在作用在于对 Caspase-3的影响，与 Huber等[11]基于慢性淋巴细胞白血病的观察中得出的结论相符。

为突破靶向治疗疗效欠佳的瓶颈问题，方案之一是更精确地了解受体表达情况(药敏检测)。但鉴于细胞信号传导通路之间存在的交叉[4]，即使实现了一条通路的成功阻断，信号也可以通过旁路传导而使预计的疗效无法实现。因此有理由认为:发现不同通路的结点来发挥有利的信号增益可能是另一种更可行的解决方案[5]。本研究结果证实索拉菲尼与华蟾素通过 RAF和 FAS双通路干预及 Mcl-1这一结点发挥了协同抑制作用，机制在于索拉菲尼通过对华蟾素作用下 FAS通路的信号放大作用而上调了离体肝癌细胞的凋亡，这可以为上述药物在临床上的合理联合提供理论基础;另一方面表明索拉非尼可能具有影响肝癌细胞株 SMMC-7721的 Mcl-1蛋白降解能力，其上游事件值得进一步研究。

[1]陈建国，宋新明.中国肝癌发病水平的估算及分析[J].中国肿瘤，2005，14(1):28-31.

[2]Scott MW，Carter C，Tang L，et al.BAY43-9006 exhibits broad spectrum oral antimuor activity and targets the RAF/MEK/ERK pathway and receptor tyrosine kinases involved in tumor progression and angiogenesis[J].Cancer Res，2004，64(19):7099-7109.

[3]张莉，李军民，钱樱，等.华蟾素诱导 U937细胞凋亡及其作用机制[J].肿瘤，2007，27(5):341-344.

[4]Olayioye MA，Olayioye MA，Neve RM，et al.The ErbB signaling network:receptor heterodimerization in development and cancer[J].MBO J，2000，19(13):3159-3167.

[5]Ayyanan A，Civenni G，Ciarloni L，et al.Increased Wnt signaling triggers oncogenic conversion of human breast epithelial cells by a Notch-dependent mechanism[J].Proc Natl Acad Sci USA，2006，103(10):3799-3804.

[6]Liu L，Cao Y，Chen C，et al.Sorafenib locks the RAF/MEK/ERK pathway，inhibits tumor angiogenesis，and inducestumor cell apoptosis in hepatocellular carcinoma model PLC/PRF/5[J].Cancer Res，2006，66(24):11851-11858.

[7]薛骞等，卢丽琴，袁国荣.华蟾素联合 TACE术治疗中晚期肝癌患者 32例临床研究[J].江苏中医药，2010，42(2):22-24.

[8]Masuda Y，Kawazoe N，Nakajo S，et al.Bufalin induces apoptosis and influences the expression of apoptosis-related genes inhuman leukemia cells[J].Leuk Res，1995，19(8):549-556.

[9]Watabe M，Masuda Y，Nakajo S，et al.The cooperative interaction of two different signaling pathwaysin responseto bufalin induces apoptosis in human leukemia U937 cells[J].J Biol Chem，1996，271(24):14067-14072.

[10]Weng C，Li Y，Xu D，et al.Specific cleavageof Mcl-1 by caspase-3 in tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand(TRAIL)-induced apoptosis in Jurkat leukemia T cells[J].J Biol Chem，2005，280(11):1049.

[11]Huber S，Oelsner M，Decker T，et al.Sorafenib induces cell death in chronic lymphocytic leukemia by translational downregulation of Mcl-1[J].Leukemia，2011，4(2):1038-1039.