郭成永，焦保华，梁朝辉，卢圣奎

（河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄 050000）

不同组别脑胶质瘤CD133/PCNA和Nestin/PCNA双染共表达及其临床意义

郭成永，焦保华*，梁朝辉，卢圣奎

（河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄 050000）

目的探讨脑胶质瘤组织中CD133阳性细胞及NeStin阳性细胞增殖指数的共表达情况及其临床意义。方法免疫组织化学双染色方法检测CD133/增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）及NeStin/PCNA在不同级别脑胶质瘤中共表达情况，并对它们之间的关系进行分析。结果CD133/PCNA和NeStin/ PCNA在脑胶质瘤中，高级别组（III，IV级）表达高于低级别组（I，II级），差异有统计学意义（P＜0.05）。结论CD133/PCNA和NeStin/PCNA在脑胶质瘤中的表达情况随着肿瘤恶性程度的增高而增强，病理级别越高，表达越强。

神经胶质瘤；免疫组织化学；临床方案

胶质瘤占中枢神经系统肿瘤的40.49%，其生长特点为浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，可累及多个脑叶，针对脑胶质瘤虽然给予了积极的手术及放化疗治疗，仍很难避免其复发，危及患者生命。因此寻找脑胶质瘤特异性治疗靶点及治疗策略的改变势在必行。Singh等［1］研究发现具有干细胞标志物CD133的肿瘤细胞在脑肿瘤发生、发展过程中起重要作用，是形成不同分化程度肿瘤细胞和促使肿瘤不断生长的根源，从而称之为脑肿瘤干细胞（brain tumor Stem cell）。胶质瘤中肿瘤干细胞与放化疗抗拒性密切相关，是恶性胶质瘤治疗失败的主要原因。CD133和NeStin是人们最常用的胶质瘤干/祖细胞标记物［2］，而增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）作为肿瘤细胞增殖状态的指标，广泛应用于增殖程度评价［3］。本研究通过比较CD133与PCNA和NeStin与PCNA在不同级别胶质瘤中的共表达来研究胶质瘤干细胞的增殖指数，探索胶质瘤干细胞对肿瘤组织增殖的影响。

1 资料与方法

1.1 病例资料：本研究所用95例标本均取自河北医科大学第二医神经外科200S—2009年手术切除人脑胶质瘤组织，所有标本均经病理检查确诊。

1.2 主要试剂与仪器设备：兔抗人CD133多克隆抗体（浓缩型，博奥森）；鼠抗人NeStin单克隆抗体（浓缩型，北京中杉）；鼠抗人PCNA单克隆抗体（浓缩型，北京中杉）；SP免疫组织化学试剂盒购于河北博海生物公司；DAB显色剂，碱性磷酸酶底物5-溴-4-氨-3-吲哚基-磷酸盐/四唑硝基蓝显色浓缩液购于北京中杉生物技术有限公司公司。光学显微镜（Leica）及光学显微镜照相系统（olympuS）；石蜡自动包埋脱水机，连续切片机（Leica）切片。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫组织化学染色：石蜡切片，按常规SP法进行免疫组织化学染色，CD133一抗（1∶100），NeStin（1∶100），用PBS液代替一抗作阴性对照，DAB显色，复染，高倍显微镜下观察结果。

1.3.2 双重免疫组织化学染色：95例均在另一部分研究中进行CD133、NeStin表达的检测，其中证实存在CD133表达的62例胶质瘤标本纳入本研究进行CD133/PCNA共表达研究（参照WHO 2007年中枢神经系统肿瘤分类标准［4］）其中WHOⅠ级、WHOⅡ级为低级别，计21例；WHOⅢ级、WHOⅣ级为高级别，计41例。在另一部分实验中证实存在NeStin表达的70例脑胶质瘤标本纳入本研究进行NeStin/PCNA共表达研究（参照2007年WHO神经系统肿瘤分类分级标准）其中WHOⅠ级、WHOⅡ级为低级别，计23例，WHOⅢ级、WHOⅣ级为高级别，计47例。由于所购一抗部分为同一来源试剂，所以均采用间接二步法进行免疫双染色。石蜡切片常规脱蜡水化，切片置于枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中煮沸（120℃，15～20 min）进行抗原修复，冷却至室温，用PBS液冲洗，血清封闭后37℃孵育0.5h，加一抗后，4℃过夜，第2天PBS漂洗，加二抗37℃孵育0.5h，PBS漂洗，加三抗37℃孵育0.5h，DAB显色后，PBS漂洗，加二标一抗，4℃过夜，第3天PBS漂洗，最后加入二标二抗三抗过程同前，碱性磷酸酶标记链霉卵白素（1∶200）显色，复染细胞核，蒸馏水漂洗30min，9S%甘油封片，其中用PBS代替一抗作为阴性对照，9S%甘油封片观察，染色结果封片。

1.4 结果判断：PCNA为核抗原，定位于增殖期细胞核，以胞核出现棕褐色染色为阳性，CD133与PCNA共表达为同一细胞内胞浆或胞膜出现褐红色，胞核出现棕褐色为阳性。NeStin与PCNA共表达为同一细胞内胞浆或胞膜出现褐红色，胞核出现棕褐色为阳性。以上结果均在低倍镜和高倍镜下观察，并在高倍镜（×400）下随机计数100个标记细胞，计算双染阳性细胞数占标记细胞总数的百分比，PCNA阳性率剔除了血管内皮细胞增殖的影响，每个肿瘤标本计数3张切片，计数结果取3张切片计数结果的平均值。

1.5 统计学方法：应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分率表示，采用χ2检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 脑胶质瘤CD133/PCNA（C/P）共染阳性细胞增殖指数及其与胶质瘤病理级别的关系：低级别胶质瘤组织细胞中C/P共表达呈阴性或低表达（图1A、B）高级别胶质瘤组织细胞中呈强的C/P共表达（图1C，D），CD133阳性细胞增殖率，低级别胶质瘤组织中CD133阳性细胞率低于高级别胶质瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 脑胶质瘤组织CD133阳性细胞增殖率及其与病理级别关系Table 1 The relationship between tumor grading and CD133-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

2.2 脑胶质瘤NeStin/PCNA（N/P）共染阳性细胞增殖指数及其与胶质瘤病理级别的关系：低级别胶质瘤组织细胞中NeStin与PCNA共表达呈阴性或低表达（图2A、B），高级别胶质瘤组织瘤细胞中呈强的NeStin与PCNA共表达（图2C、D），NeStin阳性细胞增殖率在低级别胶质瘤组织中NeStin阳性细胞率低于高级别胶质瘤组织，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 脑胶质瘤组织Nestin阳性细胞增殖率及其与病理级别关系Table 2 The relationship between tumor grading and Nestin-positive cell proliferation rate in gliomas （n，%）

3 讨 论

长期以来，胶质瘤的病因、起源和治疗一直是神经外科领域研究的热点问题，存在多种假说和争议，至今仍无明确的结论，而脑胶质瘤干细胞假说的发现，为胶质瘤的起源提供了新的思路［5］。该学说认为脑胶质瘤之所以能够发生恶性生长，与肿瘤内存在少量的增殖活性旺盛的肿瘤干细胞密切相关，这些少量的具有干细胞属性的肿瘤细胞能够通过对称性分裂形成子代干细胞，不对称性分裂形成子代干细胞和肿瘤前体细胞，随着干细胞池的逐渐扩大而形成脑肿瘤，并表达脑肿瘤干细胞特征性标志物CD133和NeStin，因此在理论上神经上皮肿瘤中NeStin或CD133的阳性细胞率能够代表着脑肿瘤干细胞在异质性肿瘤组织内部的含量。Shibahara等［6］根据肿瘤中NeStin免疫组织化学表达的数量和强度来判断胶质瘤的恶性程度，他们发现NeStin表达呈近血管簇状或巢状分布，有利于肿瘤细胞的自我更新、增殖及沿细胞间隙侵袭性生长的特性。而作为反映肿瘤干细胞特性的另外一个指标CD133，被认为是迄今为止发现的胶质瘤干细胞最重要的标记物之一，主要在干细胞及前体细胞上［7］，通过免疫组织化学的方法证实不同级别胶质瘤中CD133阳性细胞差异有统计学意义，恶性程度越高的肿瘤中CD133阳性细胞比例就越高，二者呈正相关［8］。PCNA可作为评价肿瘤细胞增殖状态的指标，为DNA聚合酶辅助蛋白，调节DNA的合成，影响细胞增殖；同时它也是一种细胞周期调节蛋白，其表达的程度和含量能够反映细胞增殖活性，因而PCNA已经广泛应用于肿瘤的细胞增殖和恶性程度的判断。查阅文献发现［3］，通过免疫组织化学染色方法来检测PCNA的表达，可反映细胞增殖活性，其阳性率和阳性强度与肿瘤分级、分期以及预后密切相关。

综上所述，以上各指标均能在一定程度上和（或）不同层次上反映胶质瘤恶性增殖的生物学特性，国内外研究成功利用双染技术来检测CD133/ KI67共表达情况，能够更好的反映患者预后［9］。那么作为肿瘤增殖指标的PCNA与CD133、NeStin共表达是否同样能够表现出其优点。本文通过免疫组织化学方法检测了不同级别脑胶质瘤，发现在低级别组和高级别组胶质瘤中CD133/PCNA共染阳性率细胞分别为42.S6%及73.17%，经检验2个级别组之间差异有统计学意义，同样NeStin/PCNA共染阳性细胞率在低级别和高级别组为47.62%和 S0.S5%，2组之间差异有统计学意义。这表明随着胶质瘤级别增加，恶性程度增高，增殖率明显升高，和已有文献相一致［11］，二者呈正相关。说明在高级别的胶质瘤中细胞分化增殖和自我更新活跃，表明胶质瘤的复发有其内在必然性，我们在高级别病理标本中图像中可见有未有阳性细胞表达的阴性标本，因肿瘤干细胞有聚居现象巢性分部，我们想是未切到干细胞分布区，NeStin/PCNA共染细胞阳性率在低级别和高级别组均高于CD133/PCNA共染细胞阳性细胞率，我们认为NeStin也是一种中枢神经系统多功能干细胞标记，因而CD133阳性细胞更具相对特异性。而这2种细胞是主要增殖细胞，在胶质瘤的发生和发展中占主要地位。CD133/PCNA或NeStin/PCNA细胞在低级别组中低表达，而在高级别组中高表达，说明在低级别组中脑肿瘤干细胞增殖力较弱或没有增殖处于静息状态，而在高级别组中增殖比较活跃。在CD133和NeStin均表达的状态下进行CD133与PCNA和NeStin与PCNA的共表达检验，每个实验组中仍有非表达的情况出现，共表达率差异有统计学意义，说明即使检测出CD133和NeStin的表达，也不能完全反映肿瘤的术后增殖和复发情况，不能为治疗提供准确的反馈信息，所以可以说CD133与PCNA和NeStin与PCNA的共表达检验研究为临床提供了胶质瘤更准确信息，其临床意义比单一检验CD133和NeStin的表达为胶质瘤预后判断更具有临床实际意义。

值得注意的是，通过CD133/PCNA和NeStin/ PCNA共表达双染技术，我们在脑胶质瘤干细胞中同样发现了“壁龛”现象，与文献报道相一致［11］，壁龛具有促进肿瘤微血管形成，微血管的形成又促进肿瘤干细胞恶性增殖和自我更新的特性，另外壁龛可以使处于细胞周期的停滞于G0期，处于未分化的沉寂状态，这些因素促使肿瘤干细胞产生放化疗抵抗性。

总之，通过检测CD133/PCNA、NeStin/PCNA共表达双染技术，有利于更准确地判断胶质瘤生物行为和评估患者预后，CD133及NeStin作为脑肿瘤干细胞标记物在现阶段具有重要意义，利用CD133/ PCNA及NeStin/PCNA的表达与肿瘤恶性程度病理级别之间的关系，研究胶质瘤的自我更新、多向分化及其致瘤能力背后的分子机制及治疗抵抗性及复发的内在调控过程以及如何打破这种调控，为临床诊治提供依据，为胶质瘤干细胞的研究拓展广度和深度。最终，开发出特异的有效的生物学方法来针对胶质瘤干细胞进行高特异性的靶向治疗，那对于胶质瘤的治疗将产生极大的推动。（本文图见封三）

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THE SIGNIFICANCE OF IMMUNOHISTOCHEMICAL DOUBLE STAINING OF CD133/PCNA AND Nestin/PCNA COEXPRESSION IN THE BASIC AND CLINICAL GLIOMA RESEARCH

GUO Cheng-yong，JIAO Bao-hua*，LIANG Zhao-hui，LU Sheng-kui
（Department of Neurosurgery，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiangzhuang 050000，China）

ObjectiveTo explore the colocalization of CD133，neStin and proliferating cell nuclear antigen（PCNA）in human brain glioma.MethodsImmunohiStochemical double Staining method waS uSed for determining CD133 and PCNA，NeStin and PCNA co-expreSSion in human brain gliomaS reSpectively.ResultsThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/PCNA in advanced group were higher than low-grade one.The difference waS StatiStically Significant（P＜0.05）.CD133 waS poSitively correlated with PCNA.ConclusionThe expreSSion of CD133/PCNA and NeStin/NeStin/PCNA increaSe with the malignancy degree of glioma.The higher the pathological grade，the Stronger the expreSSion.

glioma；immunohiStochemiStry；clinical protocdS

I331

A

1007-3205（2011）07-0774-04

2011-01-06；

2011-05-20

郭成永（1974-），男，河北定兴人，河北医科大学第二医院主治医师，医学硕士研究生，从事神经外科学胶质瘤诊治研究。

*通讯作者。E-mail：jiaobh2000@163.com

10.3969/j.iSSn.1007-3205.2011.07.011