刘衍志，崔 燎

(1.广东天然药物研究与开发重点实验室，广东 湛江 524023;2.广东医学院药理教研室，广东 湛江 524023)

1 简介

HPMA(N－2－羟丙基-甲基丙烯酰胺聚合物)是1975年由Kopecek实验室研究合成出来的多聚物。起初HPMA被设计成血浆增容剂，几十年后此种水溶性多聚物的应用范围不断扩展，从工业应用到大分子药物，逐渐在高分子治疗领域中扮演重要的角色。HPMA最先应用于作为抗癌药物的载体，取得了显著的成效，现在至少有5种相关药物处在不同的临床试验阶段［1］。随着对HPMA药物输送系统研究的不断深入，HPMA用于药物载体的研究逐渐拓展到骨骼疾病与炎症疾病等领域。

HPMA的创造者Kopecek说，经过详细研究一系列亲水性聚合物的结构和它们的生物相容性的关系后，选择了N取代的甲基丙烯酰胺做为他们的目标，因为在α－碳取代和N－取代的酰胺键能够保证聚合物侧链的水解稳定性［2］。把HPMA作为药物载体的特点如下:

1.1 合成方法简单 HPMA可以通过共聚作用，同型聚合反应［3］，以及多种单体聚合而合成。聚合物的分子量和多分散性可以通过游离自由基聚合反应控制，比如说ATRP或者是 RAFT 技术［4，5］

1.2 合成出的多聚物具有良好的水溶性和生物相容性 改进疏水性小分子药物的水溶性，使药物分子的生物利用度增高，保护不稳定分子使其不容易降解，增加药物分子在血浆内的循环时间，降低药物的非特异性毒性以及增加药物在目标位点的累积［6］。

1.3 聚合物侧链可通过多种反应添加多种治疗分子，靶向分子，以及示踪分子。HPMA与药物连接结构是药物靶向到预定部位释放的重要的组成部分，根据对药物机理的研究加上对特定组织或器官具体微环境特点的研究，用不同的连接结构接上各种功能性因子［7～9］。

1.4 从机理上看，对HPMA复合药物输送系统研究发现可以改变药物的内化，细胞内的运输路径，增强药物的作用和靶向性［10］。

2 HPMA应用于骨靶向输送系统的研究

目前大部分治疗骨骼疾病的药物都没有针对骨骼的特异性，而且集中于抗骨吸收药物，在一些促骨形成药物的研究中，虽然一些药物有很好的促骨形成效果，但是常常也伴随着较强的副作用，限制了此类药物的临床应用。例如前列腺素1和2以及它们的类似物、PTH等。因此学者们致力于研究靶向骨骼的药物。骨骼是一种特殊的器官，它与其他软组织和器官的区别在于含有大量的羟基磷灰石。基于此特点，研究者们致力于寻找与羟基磷灰石具有强烈亲和力的分子，目前主要有四环素(TC)，钙黄绿素，双磷酸盐(BPs)，D构型天冬氨酸寡肽(D－Aspx)等。

2.1 HPMA－TC 首先被选为与HPMA相结合的靶向分子是四环素。四环素是一种常见的抗生素，其对骨内羟基磷灰石(HA)有着强烈的亲和力，因此极容易沉积于骨骼和牙齿中，在骨骼和牙齿的新生阶段尤为常见。在骨形态计量领域常被用来作为骨骼形成的标记物。前期的研究者利用结构简单的TC结构类似物(ATC)合成HPMA－TC复合物［11］，在最初动物体内试验表明，此复合物能很好的与体内的羟基磷灰石相结合，但是复合物在单次的大剂量注射后，出现动物死亡。急性的低血钾症被怀疑是主要的原因。

2.2 HPMA－ALN 双磷酸盐类药物能够强力抑制骨的吸收，而且对骨骼内的羟基磷灰石有非常好的亲和力。单次注射阿仑膦酸钠(ALN)，总药量的50%都分布在骨骼上。进一步发现，在体内ALN能强力附着在各种类型的骨表面，体外ALN对羟基磷灰石的附着实验证明［12］，其对羟基磷灰石结晶度成熟程度并不敏感，在各种类型的羟基磷灰石均可很好的附着。这些研究使得ALN作为骨靶向的前药有很好的前景。

在合成HPMA－ALN聚合物的早期，合成的策略是先合成甲基丙烯酸ALN单体，然后再聚合成HPMA－ALN，但这样的策略无法用常规方法从得到的甲基丙烯酸盐衍生物中分离出合成产物甲基丙烯酸ALN单体。后来转为利用同型聚合物反应，仍然存在低反应率，低ALN配合率的问题，产物的分离要求也比较高(需制备型HPLC)［13］。因此合成HPMA－ALN的路线尚需研究优化。FITC标记的HPMAALN在动物体内实验证明，复合物能够有效的螯合到骨骼上，特别是螯合在骨高转换位点［14］。

Satchi－Fainaro的实验室利用HPMA－ALN复合物的亲骨特性，在HPMA上接入强力的血管生成抑制因子TNP－470用于靶向骨肿瘤的治疗，取得了很好的效果［15］。通过可逆加成－断裂链转移聚合(RAFT)将HPMA、ALN以及TNP－470连接形成复合物HPMA－ALN－TNP－470。此复合物带有一个组织蛋白酶K－清除连接基团，当复合物正确到达骨骼位点后，裂解释放TNP－470。HPMA－ALN－TNP－470复合物能够通过抑制内皮细胞和骨肉瘤细胞的分化、迁移以及类毛细血管样微管形成，减少肿瘤的高血管渗透性，小鼠体内实验表明，复合物能显著抑制人骨肿瘤生长达96%。

2.3 HPMA－Aspx 研究证实阴极氨基酸是一些骨相关蛋白的主要构成成分，而发现唾液蛋白能够强烈的与牙釉质相结合的原因是由于唾液蛋白的一级结构中存在有阴性氨基酸序列。因此，阴性氨基酸序列可被用于发展成为骨靶向药物的靶向分子。在合成出雌二醇与天冬氨酸六肽(Asp6)的复合物(E2·3D6)实验中单次注射一天后，骨骼内的雌二醇含量是单用雌二醇的100倍，在骨骼中聚集了有效浓度的雌二醇刺激骨形成，延缓骨丢失，而且E2·3D6的使用不会像单用E2那样，出现肝脏肥大等副作用［16］。

天冬氨酸寡肽与HA的结合能力只与氨基酸的数目相关，研究者为了得到更好的骨靶向性，选择了合成用FITC(异硫氰酸荧光素)标记的D构型天冬氨酸八肽与HPMA复合物(HPMA－GG－D －Asp8－FITC)［7］。在体外的羟基磷灰石结合实验中，复合物能迅速的与羟基磷灰石结合，1 h内，80%的复合物都附着在羟基磷灰石上。健康小鼠静脉注射剂量0.5 g·kg－1P－GG －D －Asp8－FITC，在24 h后取长骨切片计量学结果显示，骨干的内膜、外膜以及骨干骺端的骨表面均可见复合物附着，尤其在骨转换高的区域，比如骨干骺端的松质骨区域［14］。复合物在去卵巢三个月后的大鼠(OVX)体内实验，依旧使用0.5 g·kg－1剂量的 HPMA －GG－D－Asp8－FITC注射，结果同样显示，复合物能够很好的结合在骨转换高的位点［17］。

HPMA－D－Asp8与HPMA－ALN骨形态计量学对比研究发现，虽然两者都很好的结合在骨高转换位点，但是它们结合的区域并不完全相同，HPMA－ALN在骨转换中的骨形成和骨吸收区域都有分布，而HPMA－D－Asp8更倾向于分布在骨吸收表面。在一项ALN与Asp8体外对羟基磷灰石结合度的对比实验证实了两者的区别，首先ALN与牙釉质的平均亲和力有190 N，而Asp8的亲和力只有100 N。其次ALN与Asp8分别与两种结晶度不同的羟基磷灰石进行粘合实验，结果ALN与不同结晶度的羟基磷灰石粘合百分率相同，而Asp8粘合百分率显著倾向于成熟的，结晶度高的羟基磷灰石(例如骨吸收表面)［12］。

至此，总结一下可以得出，TC，D－Asp8，ALN三种靶向分子的特性，TC青睐骨形成表面，D－Asp8青睐骨吸收表面，而ALN则可以等同分布于两种表面。

这些研究结果使得研究者今后在研究骨靶向药物的时候，能够不仅仅是将药物靶向到骨骼，而是可以通过选择不同的靶向分子使药物能够更进一步的靶向到骨的不同表面，从而发挥更为准确的作用。

2.4 HPMA－PGE1PGE1是强力的促骨生成因子，当给予促骨合成剂量范围的药物时，PGE1能够激活相应骨细胞表面上的的EP受体达到促骨合成的作用。它被选为第一个与HPMA聚合物靶向骨骼疏松系统相结合的治疗因子，利用之前介绍过的对骨骼有很好靶向性的P－Asp8与PGE1相结合，形成一个靶向骨骼的药物输送系统(HPMA－D－Asp8－PGE1)。此复合物包含了双靶向的设计(D－Asp8和组织蛋白酶K特异性裂解片段)。首先D－Asp8将药物系统靶向骨骼，当复合物粘附骨骼，由于破骨细胞特异性表达组织蛋白酶K，尤其倾向于粘附在骨吸收表面，特异性裂解片段裂解，释放PGE1。这样的输送系统首先能大大减少PGE1的副反应;其次使PGE1能在最需要新骨形成的区域(骨吸收表面)刺激新骨形成，保持甚至改善骨质量;再次P－Asp8－PGE1复合物能够避免PGE1在到达释放位点之前，各种可能的消除机制对PGE1的破坏，延长PGE1在体内的半衰期，最后复合物输送系统能在完成输送任务后再从骨骼中裂解清除，通过肾小球滤过排出体外［2］。

HPMA－D－Asp8－PGE1复合物进行了体外细胞评价实验，复合物分别引入到破骨细胞，成骨细胞，在它们的前体细胞以及非骨骼细胞中，观察复合物对细胞的影响及其进入细胞的途径。共聚焦荧光显微镜的结果显示，细胞均通过内吞作用将复合物“吃”入细胞，并聚集于溶酶体/内体区域，然后裂解释放PGE1。在人源的细胞培养实验中，PEG1的释放顺序为破骨细胞(FLG－OC)＞成骨细胞(Saos－2－OB)成骨前体细胞(Saos－2)，破骨前体细胞(FLG29.1)，以及控制组细胞(HS－5)。在鼠源的细胞培养实验中与人源的基本一致，但有细微差别。此实验证实HPMA－D－Asp8－PGE1复合物能顺利的进入破骨/成骨细胞内，通过结构中的组织蛋白酶K裂解片段的裂解释放PEG1，间接证实了药物输送系统将在骨骼高转换区域富集并发挥作用。另外实验还发现组织蛋白酶L和酯酶也是对PEG1的释放发挥作用的酶［18］。

HPMA－D－Asp8－PGE1复合物在老年去卵巢大鼠(OVX)的体内实验显示［19］，单次注射28 d后，去卵巢大鼠的骨形成率(BFR)，矿化表面百分率(MS)等骨形成指标与非靶向对照组相比显著提高，并且HPMA－D－Asp8－PGE1的注射没有发现常常伴随着单纯PEGs注射出现的显著的不良反应。更为重要的是，PGE1与HPMA形成靶向药物输送系统后，复合物中含有的少量PEG1能够达到以往使用大量PGE1才能达到的生骨效果。

虽然HPMA－D－Asp8－PGE1靶向输送系统展示了很好的效果，但还面临着一些问题。在人、大鼠、小鼠血浆，37℃温育测定药物稳定性实验中。HPMA－D－Asp8－PGE1复合物在人血浆中表现稳定，但在鼠类血浆中却释放了大量的PGE1，这可能是复合物结构中PGE1与HPMA相连的酯键在血浆中裂解释放了PGE1，在大鼠血浆中，酯键主要由丁酰胆碱酯酶催化裂解，而在小鼠血浆中，酯键的裂解不仅由丁酰胆碱酯酶催化，羧酸酯酶也参与了裂解［20］。这样的种属特异性使得HPMA－D－Asp8－PGE1靶向药物的发展陷入了一种尴尬的境地，因为药物的临床前评价必须在鼠类模型及其他非鼠类动物模型上评估，所以即使复合物在人血浆中表现稳定，但此在鼠类循环系统内的缺陷，使得HPMA－DAsp8－PGE1必须进一步改良。值得庆幸的是，复合物在老年OVX大鼠上的实验，并没有出现严重的与设计目的不符的结果。

3 HPMA药物靶向输送系统的设计与展望

目前HPMA药物输送系统结构的设计主要分为四部分，以HPMA－D－Asp8－PGE1复合物为例。①是HPMA;②是靶向分子;③是治疗分子;④是连接靶向分子和药物分子的连接基团 ，如图1。

3.1 HPMA分子的设计

3.1.1 HPMA的分子量的大小是药物输送系统在体内循环半衰期，消除半衰期，以至输送系统的被动靶向性的关键因素。分子量大的输送系统能够获得更长的半衰期，但其在肝和脾的聚集也响应增多［17］。

3.1.2 HPMA的构型(如图2)是药物的合成，药物的释放率等方面的关键因素，好的构型设计能够提高药物在体内的运输效率，提高药效，同时在被动靶向性方面也将带来益处(例如高通透性和滞留效应，EPR)，但是复杂的构型设计将给药物合成阶段带来困难，而且构型产生的空间位阻也会给药物的释放带来影响。目前按HPMA的侧链连接的位置不同主要分为:①直线型;②侧链型;③双链HPMA交联型;(4)多条或者星形HPMA交联型。每一种形态的空间结构对于聚合物在体内的清除率都有重要的影响，目前输送系统设计主要的应用在侧链型HPMA。

图1 HPMA－D－Asp8－PGE1复合物的结构

图2 HPMA多聚物的结构

3.2 药物分子的连接基团设计 连接基团的设计是HPMA药物靶向输送系统中控制靶向/释放的关键结构，寡肽侧链常被用于作为药物粘结/释放的位点。例如HPMA－Dox复合物［8］中出色的针对组织蛋白酶B特异的GFLG肽序列连接结构的设计，在细胞通过内吞作用将大分子物质吸收同化并定位到溶酶体聚集的部位后，GFLG裂解释放药物;还有设计pH值敏感的连接结构，基于对炎症部位的微环境研究，炎症部位酸性环境可为pH酸性敏感的连接结构提供药物释放的场所［9］。在骨靶向药物 HPMA－D－Asp8－PGE1复合物上，体现为－Gly－Gly－Pro－Nle－寡肽连接和1，6自我消除的4－胺苄醇结构(图中④和⑤)。那是研究者们参照HPMA－Dox的成功经验，针对组织蛋白酶K(破骨细胞特异分泌酶)设计的敏感寡肽序列。寡肽片段与PGE1之间用1，6自我消除的4－胺苄醇结构连接，在寡肽片段被组织蛋白酶K降解，胺苄醇发生1，6自我消除，释放PGE1。在这个设计思路中，胺苄醇与PGE1之间连接的酯键(图1中箭头)被证实为是该设计的一大缺陷。新的用于替代酯键的连接结构和针对骨病理微环境产生的pH变化敏感的连接结构都在发展中。

3.3 靶向分子和治疗分子的设计 靶向骨骼的分子目前按结合区域可以分为:①四环素，钙黄绿素及其衍生物——针对成骨表面;②D构型Asp寡肽(Asp8，Asp6等)——针对破骨表面;③双磷酸盐——成骨破骨表面都青睐。

随着针对骨骼的微环境，细胞亚细胞，分子研究的不断深入，更多的亲骨特性的因子将加入到靶向分子之中。治疗分子的选择今后也将扩展到传统中医药领域的丹参素［21］，蛇床子素［22］，淫羊藿等以及分子医药领域抗DKK1蛋白抗体，SOST硬化蛋白抗体等［23，24］。另外以溶酶体为药物释放位点的HPMA－药物复合物经过内吞作用进入细胞，在临近核区释放。我们可以得到启示，在HPMA上接上针对DNA，RNA的调控因子，使得调控因子能够直接进入核区发挥作用，这将给一些先天性缺陷疾病带来福音，但这需要对药物复合物在细胞亚细胞内的运输路径和细胞内微环境的更多的基础研究做铺垫。

HPMA上不断重复的结构和N－取代的酰胺键，使得一条HPMA侧链上除了能添加多个靶向因子和治疗因子，还能加上各种示踪分子［25］，如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)等，展示了可以在一个简单的结构上实现各种不同的功能。理想的设计是与HPMA接上的不同功能的因子都能够在合适的阶段，合适的部位释放，发挥自身固有的作用，而各种因子之间不相互干扰。但是多功能的复合物，或多或少都对其它分子产生一些影响(包括复合物分子间和复合物内部的因子之间)。一条HPMA分子上有多个疏水基团，分子内部或分子间的疏水作用力会让疏水分子在局部空间上的聚集，形成微团结构，这对药物运输、释放率都将产生影响，因此在设计复合物时就应该考虑到引入每一种因子，复合物在体内的环境中所能产生的相互作用力对设计目的的影响。复合物的分子内部和分子间的相互作用，主要由复合物链的大小和构型，疏水结构/分子的类型、含量以及在复合物中的位置，复合物的浓度以及其他因素(温度，溶剂，pH值等)的影响［2］。随着计算机技术在模拟药物设计中的运用，结合多种物理检测技术，将会指导和优化特定复合物的设计。

3.4 展望 经过30多年的发展，HPMA经受了时间的考验，展示了出色的生物相容性，分子载入的多功能性和完善发展的聚合物合成体系，使HPMA从众多聚合物载体中脱颖而出，成为研究的热点。大量的基础研究和新的HPMA复合物目前集中在癌症领域，对除癌症之外的疾病尤其是在骨骼与肌肉疾病方面的研究和新的复合物还很少，可以预见在癌症之外的疾病领域HPMA将迎来一个新的发展。

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