彭 芳，周凤梅，刘万卉

(1.烟台大学药学院，山东 烟台 264005;2.山东绿叶制药有限公司，山东 烟台 264003)

由于新化合物药物研发风险大，投资大，时间长，因此进行给药系统研究是目前各大制药公司的研究热点。注射用缓释微球是非肠释药系统(Parenteral depot system，PDS)中的一种。微球所用的聚合物载体有合成聚合物与天然聚合物两种［1］，目前常用的是合成聚合物中的生物可降解型。药物溶解或分散在聚合物基质中，可降解性聚合物在人体内经水解或酶解可降解为无毒性可吸收的小分子。作为缓释靶向制剂，微球对于改善老年人、精神类疾病患者的顺应性有非常积极的作用。基于微球制剂本身的特点(可能会发生突释)，临床也对微球制剂的质量控制尤其是释放性质提出了较高的要求，依据美国药物科学家协会(American Association of Pharmaceutical Scientists，AAPS)美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)和美国药典委员会(U-nited States Pharmacopoeia，USP)2001年4月在华盛顿召开的“非肠道持续释放及控制释放系统质量控制及实施”专题会议的总结报告［2］以及近年来的国内外微球研究的相关文献，本文就注射用微球质量控制主要指标释放度进行了综述。

目前释放度的检查方法，美国药典收载了7种，包括篮法(Basket)、浆法(Paddle)、往复筒法(Reciprocating Cylinder)、流池法(Flow Through Cell)、桨碟法(Paddle Over Disk)、转筒法(Rotating Cylinder)和往复碟法(Reciprocating Disk)。《中国药典》2010年版收载的释放度方法则包括篮法、桨法和小杯法。由于注射用缓释微球长效缓释的特性，每一支含药量相当于常规制剂的数十至数百倍，单支价值很高;同时适合制成微球的药物往往计量比较低，造成常规测定过程中释放后药液浓度低。因此从科学性和检验经济学两方面来说，常规制剂释放度测定使用的篮法、桨法和小杯法无法满足注射用微球制剂释放度测定的要求。因此微球制剂通常采用直接释药法(sample and separate methods)、透析膜扩散法(membrane diffusion method)、流池法(Continuous flow － through method)［3］等。

除测定方法外，释放介质和释放温度也是影响释放度测定结果的重要因素。鉴于微球制剂具有长效缓释的特点，在接近体温的37℃条件下其释放时间较长，时间长达数周至数月，为了提高检验效率，达到缩短时间的目的，可通过提高温度的办法来实现。要考虑体内和体外释放度的相关性［4］，以及提高温度进行加速释放后，加速释放与37℃条件下释放度曲线的相关性。

1 测定方法

1.1 直接释药法 将一定量的微球直接置入一定体积的介质中，在一定频率下振荡，定时取样，在取样的同时补充相应的新鲜介质或在测试后再将取出的介质放回去。本方法的优点是操作较为简便，成本低;主要缺点是取样过程中很难避免微球的损失，此外随着聚合物酸性降解产物的形成和积累，介质的pH值可能会持续下降。目前上市的微球制剂的释放度检查大多使用该法。

Yen等［5］对纳布咖丙酸盐可生物降解微球的体内外释放进行了研究，其中体外释放采用37℃下40 rpm的具塞锥形瓶进行水浴摇床(直接释放法的一种)，用400 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.4，0.025 M)作为释放介质，在0，0.5，1，2，4，6，8，12，24，36，48，60，72 和96 h 时间点取样并立即补充等量的新鲜缓冲液。取出的样品经5 μm滤膜过滤后用HPLC法进行测定。在96 h时药物释放了约71.1%，释放曲线见图1。

图1 纳布咖丙酸盐可生物降解微球体外释放曲线

Mu等［6］对以PLGA为载体的紫杉醇微球的体外释放进行了研究，采用37℃下130 rpm转速水浴，用磷酸盐缓冲液作为释放介质，在特定时间点取样并立即补充等量的新鲜缓冲液。

Xue等［7］采用37℃下pH 7.4的PBS作为释放介质测定PLGA/介孔二氧化硅混合结构药物释放，每隔一天取样释放液并补充新鲜缓冲液。

杨阳等［8］采用摇瓶培养法(即水浴摇床，直接释放法的一种)测定盐酸噻吩诺啡微球的体外释放度:取样品10 mg，置于50 mL三角瓶中，加入pH 7.4的磷酸盐缓冲液(含0.02% 叠氮化钠)30 mL，置于温度为(37.0±1.0)℃，速度为120 r·min－1的恒温振荡仪中，定时取样1 mL，同时补充介质1 mL。用HPLC法测定介质中药物的含量，计算累积释放度。

1.2 透析膜扩散法 将药物微球放入透析袋(管)［9～12］，置于相应介质中进行测试，该方法有利于透析膜外介质的交换，可避免样品处理过程中微球的损失和释放介质pH的改变，但操作的成本比直接释药法高。

Kostanski等［7］采用透析法测定微球的体外释放度，在7 mL透析管中加入微球和pH 4.0的醋酸盐缓冲液(0.1 M)5.0 mL，将透析管放入装有40 mL同样释放介质的50 mL外管中，外管中放置磁力搅拌器(见图2)。在每个时间点从50 mL外管中取样1.0 mL，并补充1.0 mL新鲜缓冲液。样品采用HPLC法测定，结果表明用透析法能获得更好的体内外相关性。

Park等［8］将样品溶液置于Spectra/por透析袋中，透析袋内外释放介质采用PBS，在37℃下进行微球的释放度测定。

图2 透析法测定体外释放度的装置

符旭东等［10］比较了石杉碱甲缓释微球采用透析释药和直接释药两种方法测定释放度。结果发现直接释药法所获得的体外释放度数据虽略低于透析袋法，但这种损失对结果不造成显著影响(结果见图3)。

图3 直接释药法和透析释药法对石杉碱甲缓释微球体外释放度的影响

1.3 流池法［13～16］仪器由溶剂存储瓶、恒流活塞泵、温控流通池、滤过系统、取样系统和样品收集器组成。基本原理为溶媒通过气泵的压力从储液泵中抽取，往复通过放有样品的样品池。流通池法具体分为两种，一种是循环式流通池法(闭合式系统，与传统溶出度方法接近)，是将样品置于特别设计的流通池中的样品架上，溶剂应预先加热至37℃，由恒流泵泵入。溶剂经过装有恒温装置的热交换器的水浴，进入流通池的下端温度37℃，流速可调节(2～50 mL·min－1)，与样品接触，并由流通池的上端滤过后流出。另一种是开放式流通池法(开放式系统)，与闭合式系统的主要区别是溶出介质通过流通池后不再返回，在通过流通池后使用自动取样装置按时间点进行取样，其特点是使大量新鲜的溶出介质不断地经过被测样品，使样品随时与新鲜溶出介质接触，而使药物逐渐溶解到最后溶尽为止，能够一直保持适宜的漏槽条件，适合溶解度非常小的药物［13］。本方法能较好地模拟体内环境，其缺点是设备较为复杂，成本较高。装置见图4。

图4 USP第四法装置图

Voisine等［14］采用USP第四法(流池法)测定微球的体外释放度，装置选用Sotax CE 7 smart溶出仪，含水槽、泵、1 mm玻璃微珠的流通池(直径12 mm)，流通池上装有0.45 μm玻璃纤维滤纸。37℃下，采用磷酸盐缓冲液(pH=7.4，0.1 M)作为释放介质，流速为 16 mL·min－1。

Zolnik等［15］采用USP第四法(流池法)测定地塞米松微球的体外释放度，装置选用Sotax CE 7 smart溶出仪或CY 7活塞泵，含1 mm玻璃微珠的流通池(直径12 mm)，流通池上装有0.45 μm玻璃纤维滤纸。37℃下，采用含0.1%叠氮化钠的磷酸盐缓冲液(pH=7.4，0.1 M)作为释放介质，流速为20 mL·min－1。测定结果见图5。

图5 37℃下，地塞米松的PLGA微球在磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中释放结果。(◆)采用相对分子量28k的PLGA制成的微球，(■)采用相对分子量13k的PLGA制成的微球

鉴于上述释放度测定方法各有优劣，选择方法时应综合考虑测定准确性、操作的简便性和试验成本等。

2 介质的选择

介质的pH值、离子强度以及加入的表面活性剂会影响药物的溶解度、稳定性及聚合物降解速度。长效注射微球一般采用肌注或皮下注射，而组织环境的pH为7左右，所以常采用的介质pH为7.4;常用的释放介质为磷酸盐缓冲液(PBS)［3～5，9，10，12～33］，如果药物的溶解度较低，可加入表面活性剂 SDS［3］或吐温 80［6，17，18，20，24］助溶，也有采用甲醇作为释放介质，如曲普瑞林微球。释放介质的选择应以体内外释放拟合结果为准，因此曲普瑞林微球采用甲醇而非常规的PBS，推测主要是由于采用甲醇得到的释放与体内结果更接近。

测定介质的体积，通常远小于常规的溶出度测定法，可以只有几十毫升，乃至几毫升，但必须满足漏槽状态。由于微球释放时间较长，因此与普通制剂的区别在于释放介质中加入叠氮化钠抑菌［17，18，20］，以避免释放度测定的过程中释放介质发生变化。

3 温度的选择

测定温度一般为37℃，采用加速试验的方法可以快速考察微球的体外释药行为［19，34］。有研究表明在pH 4的介质中相对分子质量为8600和28000的PLGA微球在50℃和60℃ 时，多肽药物可在30～40 h内完全释放，与体外37℃，pH 7.0介质中的真实释放时间相关性良好［34］。对于相对分子质量更高的聚合物，延长和提高加速试验的时间和温度，也能与真实时间的释放保持好的相关性。

4 体内外相关性

体内外相关性(in vitro－in vivo corelations，IVIVC)是用数学模型描述药物体外性质(药物溶出的速率或程度)与体内特性(血药浓度或药物吸收量)的关系［11］。IVIVC既可以作为药品质量的评价方法，也可用于替代考察该剂型的体内生物学表现。鉴于IVIVC能够减少体内研究(人体和动物)数量，因此具有非常重要的意义［35］。结合体内外相关性的研究结果，筛选出最适宜的体外释放条件［18］。

图6 石杉碱甲缓释微球体内外释放相关性(●pH 4.0体外释放，▲ pH 7.4体外释放，■体内释放)

5 总结

作为长效缓释制剂，体外释放度是一个很重要的质量控制指标，在研发过程中能够用来监测批间差异、评价生产过程中的可能变化以及优化处方等［3］。关于微球体外释放度测定的方法，一般采用使体外释放条件尽可能地模拟体内的方法，所选择的方法和条件满足体内外相关性好这一基本原则。此外，由于注射用缓释微球剂型的特殊性，其释放度测定周期较长，为了在日常检验工作中更加方便快捷，有必要建立体外释放度的加速试验方法。

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