唐燕平，魏 佳

(江苏奥赛康药业有限公司，江苏 南京 211112)

培美曲塞二钠(pemetrexed disodium)是一种胸苷酸合成酶/氢叶酸还原酶双重抑制剂，结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，能较强的破坏细胞内叶酸依赖性正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤生长［1］。具有一定的骨髓抑制作用、肾毒性和肠道副反应。目前已获SFDA批准上市，用于恶性胸膜间皮瘤一线治疗和非小细胞肺癌二线治疗。在研究中发现，培美曲塞二钠国家药品标准中有关物质检查法［2，3］，无法同时检查出所有杂质及中间体，因此，我们对国家标准中规定的有关物质检查法进行优化，不仅能够有效的控制本品的有关物质，而且也同样适合粗品以及各步中间体的检测，真实反映药品的质量，有助于发现目前产品中的质量问题，进而促使产品质量的提高。

1 仪器及试药

高效液相色谱仪1200型(美国 Agilent公司)，包括G1312二元泵，G1315D二极管阵列检测器，G1316A柱温箱，G1367B自动进样器，G1322A在线脱气机，ChemStation for LC 3D systems工作站(Rev.B.04.01)，德国赛多利斯 BP211D 电子分析天平。

培美曲塞二钠对照品由南京海光应用化学研究所提供，批号为20081001，含量 99.4%;培美曲塞二钠3批(批号:090201、090202、090203)及原料对氨基苯甲酸、中间体有:Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氢 －4－氧代 －1H －吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氢－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰－L－谷氨酸二乙酯均由江苏奥赛康药业有限公司提供;乙腈为色谱纯，磷酸、磷酸铵为分析纯;水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及测定方法 色谱柱为Shim－Pack C18VPODS(150 mm ×4.6 mm，5 μm);以 0.02 mol·L－1磷酸铵溶液(用磷酸调节pH至4.0)为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱(0～10 min，86∶14;10～25 min，40∶60;25～30 min，86∶14;30～35 min，86∶14)，稀释液为流动相 A － 流动相B(86∶14)，流速 1.0 mL· min－1;检测波长 240 nm，进样体积:20 μL。

2.2 检测波长的选择 取培美曲塞二钠及各中间体适量，用稀释液溶解并稀释制成每1 mL中约含10 μg的溶液，取20 μL注入液相色谱仪，用Agilent 1200 Series DAD检测器在190～400 nm范围进行检测，记录色谱图，发现在226 nm和240 nm波长下，培美曲塞二钠有最大吸收，如用226 nm作检测波长，虽然培美曲塞二钠有明显的特征吸收，但各中间体在此波长处吸收较弱，经考察，采用240 nm作为检测波长。

2.3 专属性试验

2.3.1 各个杂质的分离及最低检测限 本品合成工艺中使用的原料是对氨基苯甲酸，中间体，Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基－4，7－二氢－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氢 －4－氧代 －1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰－L－谷氨酸二乙酯和培美曲塞二钠各适量，用稀释液配制成约10 μg·mL－1的混合溶液，按上述色谱条件进样，结果见图1－B，理论塔板数按培美曲塞二钠峰计算大于5000，各已知物质峰与培美曲塞二钠峰之间的分离度均大于1.5。取上述溶液采用逐步稀释的方法，得出培美曲塞二钠及对氨基苯甲酸，Ⅰ:3－(4－乙氧羰基苯基)－1－丙醛;Ⅱ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－2－丁醇;Ⅲ:1－硝基－4－(4－乙氧羰基苯基)－1－丁烯;Ⅳ:1－硝基－2－(2，6－二氨基－4－氧嘧啶－5－基)－4－(4－乙氧羰基苯基)丁烷;Ⅴ:4－［2－(2－氨基－4，7－二氢－4－氧代－1H－吡咯［2，3－d］嘧啶 －5－基)乙基］苯甲酸;Ⅵ:4－［2－(2－氨基 －4，7－二氢 －4－氧代 －1H－吡咯［2，3－d］嘧啶－5－基)乙基］苯甲酰 －L－谷氨酸二乙酯的检测限分别为 0.5632，1.231，1.362，1.135，1.036，0.9154，0.8346 ng(S/N=3)。

2.3.2 强酸破坏试验 精密称取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加0.1 mol·L－1盐酸溶液 2 mL，摇匀，于室温放置 4 h后，用0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液调pH至中性，然后加稀释液稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，结果见图1－C。

2.3.3 强碱破坏试验 精密称取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加 0.1 mol·L－1氢氧化钠溶液2 mL，摇匀，于室温放置4 h后，用0.1 mol·L－1盐酸溶液调 pH 至中性，然后加稀释液稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，结果见图1－D。

2.3.4 氧化破坏试验 精密称取本品12.5 mg，于25 mL量瓶中，加30%过氧化氢2 mL，摇匀，于室温放置1 h后，加稀释液稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，结果见图1－E。

图1 专属性试验图谱

2.3.5 热破坏试验 精密称取本品12.5 mg，于 25 mL量瓶中，加水2 mL，摇匀，于水浴中加热10 min后，取出，放冷至室温，加稀释液稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪，结果见图1－F。

2.3.6 光破坏试验 精密称取本品12.5 mg，于 25 mL量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，于4500 lx光照度下放置4 h后，取20 μL注入液相色谱仪，结果见图1－G。

结果表明本品在强酸、强碱作用下较稳定，在光照、高温、氧化剂作用下发生不同程度的降解，且各条件下的降解产物峰与主成分峰均能达到良好的分离。故本色谱条件能满足有关物质考察的要求。

2.4 线性关系考察 精密称取培美曲塞二钠对照品约50 mg，置50 mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得培美曲塞二钠对照品贮备液。

精密量取培美曲塞二钠对照品储备液 0.1、0.5、2.0、5.0、7.0、10.0 mL，分别置 20 mL 量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，即得 5，25，100，250，350，500 μg·mL－1的对照品溶液。分别取上述6种浓度的溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C(μg·mL－1)为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归。回归方程为A=5619.8C+19013;r=0.9999(n 0=3)。试验结果表明，培美曲塞二钠浓度在5.1～506.8 μg·mL－1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 定量限检测限 取培美曲塞二钠对照品贮备液，以稀释液逐级稀释后进样测定，按10∶1信噪比作检测定量限，结果为1.5 ng;按3∶1信噪比作最低检测限，结果为0.5 ng。

2.6 溶液稳定性试验 精密取培美曲塞二钠(批号:090201)约25 mg，置50 mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

取供试品溶液，室温自然条件下放置，分别在 0，1，2，4，6，8 h取20 μL注入液相色谱仪进行测定，8 h内峰面积没有明显变化，RSD为0.32%，表明培美曲塞二钠供试溶液室温自然放置在8 h内是稳定的。

2.7 重复性试验 取培美曲塞二钠(批号:090201)约25 mg，6份，分别置50 mL量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，精密量取1 mL置100 mL量瓶中加稀释液稀释至刻度，摇匀，作对照溶液，分别精密量取20 μL注入液相色谱仪进行测定，用自身对照法计算有关物质，平均为0.48%，RSD为1.89%，表明方法的重现性良好。

2.8 有关物质检查 取本品适量，精密称定，加稀释液溶解并稀释制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为供试品溶液;精密量取适量，加稀释液稀释制成每1 mL含5 μg的溶液，作为对照溶液。取对照溶液20 μL，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%;精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主峰保留时间的4.5倍。供试品溶液的色谱图如有杂质峰，单个杂质的峰面积不得大于对照溶液主峰面积的1/2倍(0.5%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1%)(供试品溶液中的任何小于对照溶液主峰面积的0.01倍的峰可忽略不计)。

2.9 样品测定 取培美曲塞二钠样品3批，按“有关物质检查”项下方法制备供试品溶液，测定有关物质，结果见表1。

表1 样品有关物质测定结果(%)

3 讨论

3.1 取合成原料、中间体及成品适量，以流动相为溶剂，在190～450 nm扫描。结果表明成品在226 nm、240 nm波长处有明显的特征吸收，但各个中间体在此波长处吸收较弱，而在240 nm波长处有最大吸收，因此综合考虑，确定本品测定波长为240 nm。

3.2 流动相的选择 本实验考察了多种时间梯度洗脱程序，不是基线不容易稳定，就是杂质峰之间分离不好，运用本色谱条件不但主峰及杂质峰出峰时间适宜，并能有效地分离各个杂质峰及起始原料及中间体。经破坏后的分解产物在此条件下也能有效地与主峰完全分离，最终确定了培美曲塞二钠原料中有关物质测定的色谱分析条件。

3.3 对药品中相关物质的控制是当前药品质量控制的关键，虽然HPLC法是最常用的检测方法，但合理的HPLC系统是保证检测结果具有可信度的前提。此外，对本品中有关物质表征的正确与否，是能否真实反映药品质量的另一关键。本文将其各自原料药的有关物质控制方法，从色谱条件到质控限度方面均相结合，所确定的分析系统有助于发现目前产品中的质量问题，进而促使产品质量的提高

［1］李树婷，马飞，孙燕.抗肿瘤代谢新药－培美曲塞［J］.癌症进展杂志，2005，3(5):68 －73.

［2］Hamilton CL，Kirkwood JA.Column － switching highperformance liquid chromatographic method for the determination ofa thymidylate synthase inhibitor，LY231514，all investigational agent for the treatment of solid tumors，in human plasma［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1994，654(2):297，303.

［3］陈宁，张根元，戈文兰，等.培美曲塞二钠中有关物质的HPLC法测定［J］.中国医药工业杂志，2008，39(3):214－215.