王瑛华，王小菁

(1.华南师范大学生命科学学院,广东省植物发育工程重点实验室，广东广州 510631；2.肇庆学院生命科学学院，广东肇庆 526061)

干旱、盐、极端温度、高光、重金属等非生物胁迫，严重影响了植物的生长和作物产量，对农业生产造成巨大威胁[1].非生物胁迫是全球范围内作物减产的主要原因，几种主要的作物平均减产高达50%以上[2].为了适应各种胁迫环境，植物在长期的进化过程中发展形成了各种不同的分子、细胞和生理生化机制，以抵御、适应各种不利生境[3].至今尚未完全阐明逆境对植物产生危害和植物抗逆的机制，但从遗传、细胞和生理生化多方面对抗逆机理的研究已取得了显著的进展[4-6].如一系列逆境相关基因得到克隆和功能鉴定， 将有用的基因转入作物，提高作物抗非生物逆境的能力[7-12].然而，发现和研究新的抗逆蛋白仍然是植物抗逆性研究的热点之一.

胁迫相关蛋白(Stress Associated Protein，SAP)是一类涉及胁迫应答和胁迫调控的锌指蛋白，近年研究发现SAP蛋白在植物中具有抗非生物胁迫的功能.本文对SAP蛋白与植物抗逆性的关系作一评述.

1 SAP蛋白的结构和分类

1.1 SAP蛋白的结构

SAP蛋白组成一个重要的涉及胁迫应答和胁迫调控的基因家族,蛋白家族具有A20/AN1 锌指结构域特征[13].动物SAP蛋白研究较深入，例如肿瘤坏死因子(TNFα)、人AWP1和ZNF216等.在人的内皮细胞中，具A20结构域的TNFα通过抑制核因子κB(NFκB)活性调控免疫应答.A20结构域位于蛋白的C端，特征是具有多个半胱氨酸2/半胱氨酸2(Cys2/Cys2)锌指基元，它的保守序列为CX2-4CX11CX2C(X代表任意氨基酸)[14].另一个锌指结构AN1最早发现于编码非洲爪蟾动物半球母体RNA的蛋白中[15].AN1锌指结构域的保守序列为CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC.目前AN1结构域确切的生物学功能仍不清楚，发现人ZNF216蛋白中的AN1结构域与TRAF6(TNF受体相关因子6)相互作用[16].人AWP1与一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PRK1相互作用，在细胞调控中发挥重要作用，如参与蛋白磷酸化和细胞凋亡过程[17].人ZNF216蛋白负调控NFκB的免疫调控激活途径和抗细胞凋亡基因的转录[16]，小鼠ZNF216蛋白具有泛素化活性和去泛素化活性[18].

1.2 SAP蛋白的分类

根据SAP蛋白结构上的锌指特点，通过系统进化分析将A20/AN1蛋白家族分为2大类：类型ⅠSAP蛋白具有典型的CX2CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC结构；类型 Ⅱ 具有扩展的CX4CX9-12CX1-2CX4CX2HX5HXC结构[19].大多数类型Ⅰ成员的编码序列不含内含子且有1个A20结构域，而大多数类型 Ⅱ 成员有1个内含子却缺乏A20结构域.进化分析揭示，类型Ⅰ的进化率高于类型Ⅱ的.类型Ⅰ又分为3个亚类:ⅠA，ⅠB和ⅠC.亚类ⅠA包含42个成员，在N端具有1个完整的A20结构域，在C端则具有1个完整的AN1结构域.亚类ⅠB包括4个成员，除了水稻OsAN116以外，都有1个不完整的AN1结构域和1个A20结构域.亚类ⅠC的5个成员具有2个A20结构域或者没有该结构域.类型Ⅱ被分为2个亚类：ⅡA和ⅡB.在植物中，这2个亚类的成员均来自单子叶植物和双子叶植物，暗示植物中类型Ⅱ的SAP基因的起源可能发生于单子叶植物和双子叶植物分离之前.除了AN1结构域以外，亚类ⅡA还具有其他保守结构，如C2H2型锌指结构域.除去拟南芥AtAN19只有1个C2H2锌指，其它的亚类ⅡA成员在C端均有2个C2H2锌指.而亚类ⅡB仅有ZnF-AN1结构域，不包含其他类型的结构域.

1.3 植物中的SAP蛋白基因

具有A20/AN1锌指结构的SAP蛋白普遍存在于真核生物中，在动物中研究的较深入，但它们在植物中的功能并不十分清楚.2004年，MUKHOPADHYAY等从籼稻中克隆到1个含有A20和AN1锌指结构的基因，A20和AN1锌指分别位于N端和C段.这个基因被命名为OsiSAP1，是植物中发现的第一个SAP基因，超表达OsiSAP1的转基因烟草抵抗多种非生物胁迫的能力增强[20].随后玉米[19]、毛果杨[19,21]、莱茵衣藻[19-21]、粳稻[22-23]、拟南芥[21-24]、獐毛[25]、番茄[26]等物种中的SAP基因相继被研究.在已经完成基因组测序的植物中该蛋白家族基因广泛存在，例如水稻和高粱中均含有18个SAP基因，拟南芥中有14个SAP基因，毛果杨、番茄和葡萄的SAP基因家族分别有19、13和10个成员，玉米中至少有11个SAP基因，低等生物莱茵衣藻中仅有3个[19, 21-26].

不同的蛋白质通常分布于细胞的不同部位，它们的空间定位与其功能密切相关.植物SAP蛋白中水稻OsiSAP8和ZFP177亚细胞定位[1,22].分析OsiSAP8基因产物，该基因缺乏核定位信号(NLS)或DNA结合域.Sosui分析和 pSORT分析预测OsiSAP8是一个亲水性可溶的细胞质蛋白.GFP-OsiSAP8融合蛋白特异性地定位于烟草叶片表皮细胞的细胞质中，这一实验结果证实与许多锌指蛋白不同，OsiSAP8是一个细胞质蛋白[1].与OsiSAP8相似，HUANG等人研究水稻ZFP177蛋白(即OsiSAP9)时发现，ZFP177序列中无信号肽、跨膜结构域和典型的核定位信号；构建ZFP177-GUS融合载体瞬时转化烟草叶片，结果发现ZFP177-GUS融合蛋白遍布于烟草叶和根细胞中，从而证明了ZFP177是一个细胞质蛋白[22].与之相似，动物细胞中的A20蛋白也是一个细胞质蛋白[27].这些结果说明，植物SAP基因家族的产物可能是细胞质蛋白.

2 植物SAP基因的表达调控

关于植物SAP基因表达模式的研究主要集中于水稻和拟南芥这2种模式植物中.籼稻OsiSAP1在水稻基因组中是一个无内含子的单拷贝基因.OsiSAP1受到不同类型胁迫的诱导，诸如冷、干燥、盐、水浸没、重金属以及伤害等，另外也受到胁迫激素ABA的诱导[20].VIJ等人应用实时定量PCR技术分析了非生物胁迫对水稻SAP家族基因表达的影响，结果发现所有的水稻SAP基因均受到一种或几种非生物胁迫的诱导.其中，在盐和干旱胁迫下，OsSAP14和OsSAP10 的表达水平上调最高，分别为非胁迫条件下的11和22倍.OsSAP1,OsSAP9,OsSAP11,OsSAP12,OsSAP14和OsSAP17等6个基因在冷胁迫下上调表达[23].OsiSAP8是一个多种胁迫诱导型基因，受到不同的胁迫诱导，例如热、冷、盐、干燥、水浸没、伤害、重金属和ABA[1].我国研究者从粳稻中克隆到12个A20/AN1型锌指蛋白基因[22]，这些基因大多数在根、茎、叶和穗中呈组成型表达.通过基因芯片分析，发现其中4个基因(ZFP177,ZFP181,ZFP176,ZFP173)受到冷胁迫的诱导， 2个基因(ZFP181和ZFP176) 和1个ZFP157基因则分别受到干旱和H2O2处理的诱导.ZFP177对冷和热胁迫均产生应答，但受盐胁迫下调[22].在拟南芥中，大多数的SAP基因也涉及非生物胁迫应答[19].如拟南芥AtSAP12基因的转录强烈地受到冷和盐胁迫的诱导，胁迫6 h后表达水平高，24 h和48 h后降低，AtSAP12蛋白含量也有所下降[24].

Northern杂交实验表明，玉米SAP基因家族的大多数成员对非生物胁迫产生应答[19].番茄栽培种Pusa Ruby中有13个SAP基因.分析冷、热、盐、水涝、干燥等伤害以及脱落酸和氧化胁迫对这些基因表达的影响，发现所有的番茄SAP基因均对一种或几种环境胁迫产生应答[26].禾本科植物獐毛(Aeluropuslittoralis)是一种盐渍土指示植物，具有很强的抗盐、抗旱能力，也是抗性基因库的重要物种, 其体内AlSAP基因不仅受到盐、渗透、热和冷等多种非生物胁迫诱导，也受到脱落酸(ABA)和水杨酸(SA)的诱导[25].

高粱(SorghumbicolorL.Moench)是全世界种植的第五大禾谷类作物，具有C4植物高光效特征.作为粮食作物，高粱抗旱、耐盐碱和贫瘠土壤，在干旱和半干旱农业生产中占有及其重要的位置，是一种具有发展潜力的作物和筛选抗逆基因的理想材料.除此之外，它也是重要的饲料植物和酿造业原料.最近高粱的基因组序列已公布，有利于加快高粱遗传育种研究过程.

本课题组利用同源克隆技术得到了高粱SbSAP12(Sb07g021370)和SbSAP14(Sb01g005640)基因，对其进行功能分析，以期为作物的分子育种提供理论上的指导，并为改良和提高干旱、半干旱及盐碱地区植物的抗逆性提供候选基因.高粱SbSAP12基因全长753 bp，编码251个氨基酸;SbSAP14基因全长543 bp，编码181个氨基酸;SbSAP12和SbSAP14基因均无内含子.氨基酸序列比对结果显示，高粱SbSAP12蛋白与水稻SbSAP14蛋白[23]的同源性最高，达70%，与OsSAP1蛋白[20]同源性最低，为 37%;而高粱SbSAP14蛋白与水稻OsSAP18蛋白[23]具有71%的高同源性，与OsSAP16蛋白[23]同源性最低，为36%.经RT-PCR试验初步研究发现，高粱SbSAP12和SbSAP14基因的表达受到干旱胁迫、盐胁迫和植物激素ABA的诱导，功能可能与植物抗逆相关(结果待发表).

3 植物SAP基因的转基因研究

目前，受到全球变暖的影响，环境胁迫对植物生长造成的压力日益增加，培育具有抗逆能力的新品种变得越来越重要[28].转基因技术为提高植物的抗非生物胁迫能力提供了一条行之有效的新途径.对SAP基因家族转基因研究的结果表明，SAP蛋白在植物抵御多种非生物胁迫过程中发挥着重要的功能.如超表达OsiSAP1的转基因烟草增强了对冷、干旱、高盐等逆境的抗逆能力，无论在胁迫环境还是在恢复阶段，转基因植株在鲜质量、叶绿素保留率、叶片发育和种子萌发率等方面均优于野生型植株[20].在此之后，水稻中另外2个SAP基因取得了与OsiSAP1相似的研究结果.其中，OsiSAP8受到热、冷、盐、干燥、重金属等多种胁迫诱导，超表达OsiSAP8的转基因烟草和水稻植株，对盐、干旱和冷胁迫的耐受力在种子萌发率、胁迫恢复后鲜质量明显提高；值得一提的是，超表达OsiSAP8的转基因水稻在开花期对盐和干旱具有抗性，而且与未受胁迫的转基因植株相比产量上没有损失[1].超表达ZFP177(OsiSAP9)的转基因烟草植株对低温和高温胁迫的耐受力增强，但同时对盐和干旱胁迫敏感性增强[22].另有研究发现，将克隆自獐毛的AlSAP基因转化烟草，超表达的转基因烟草植株表现出对盐、干旱、热和冷冻胁迫的耐受力增强，在高盐和干旱条件下，野生型植株在营养生长期就已经死亡，转基因植株能够产生可育的种子；除此之外，还发现与胁迫有关的8个基因(CAT1，MnSOD,APX，osmotin，NtERD10A，NtERD10B，NtERD10C和NtERD10D)在转基因烟草植株中表达水平比野生型中的高[25].本实验室将高粱SbSAP14基因异源转化水稻，超表达水稻植株抗盐胁迫能力明显增强(结果待发表).SAP基因家族在植物应答不同的非生物胁迫过程中发挥不同的功能，如OsiSAP1和OsiSAP8具有抗冷、干旱和高盐的功能，ZFP177具有抗低温和抗高温的功能，而AlSAP则同时具有抗干旱、高盐以及抵御热胁迫和冷胁迫的功能.超表达该家族基因可以增强植物的抗逆性，表明SAP基因家族在抗性作物分子育种中可望成为具有应用价值的有效基因.

4 展望

今后需要针对以下问题展开深入研究：(1)进一步研究胁迫条件下植物SAP基因表达调控的信号转导途径及基因的开关调控过程；(2)分离和克隆植物SAP基因的启动子，研究启动子区顺式作用元件与基因表达的关系；(3)提取和纯化SAP蛋白，研究SAP蛋白的结构和功能；(4)利用植物基因工程的手段将SAP基因转入植物体中，从分子水平了解SAP蛋白在植物抗逆中的作用及其机制并培育抗逆品种和品系.总之，对植物SAP基因家族的全面了解，有利于全面认识植物对逆境应答和适应的生理生化及分子机制，为利用分子育种技术开发抗逆新品种奠定理论基础.

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