王世华，高双成，郝转芳，施 江，付国占

(1.河南科技大学农学院，河南洛阳471003;2.中国农业科学院作物科学研究所，北京100081)

0 前言

同工酶的形成是生物体基因结构差异造成的，在进化过程中有一定的保守性［1］。同工酶是基因和性状的连接物，具有明显的种属、组织和发育阶段的特异性，既是生理指标，又是可靠的遗传标志［2］。同工酶技术，是通过凝胶电泳的方法，将不同的同工酶酶带分离开，经过染色形成酶带谱，在遗传育种、生长发育、物种起源等领域的成为一种重要的研究工具，也可作为鉴定生物基因型是否有差异的可靠指标［3－5］。最早将同工酶应用于玉米杂种研究的是Schwartz，他发现了杂交后代中有新的酶带表达(称为杂交酶)，并试图把它和杂种优势联系起来［6］。中国科技工作者利用非变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，研究了过氧化物酶、酯酶等同工酶与玉米杂种优势的关系［7－10］，极大地推动了同工酶在玉米杂种优势预测和优良品种选育上的应用。目前，国内做同工酶研究的较多，刘正蒙利用酯酶同工酶测定了25个玉米自交系的酶谱距离，对组合间酶谱距离与其籽粒产量杂种优势进行了相关分析，二者呈显著相关［11］。刘新文等通过在玉米不同发育阶段选取不同部位组织样品，进行POD和EST同工酶的电泳分析，发现不同发育阶段不同部位组织样品，其同工酶带数与活性是不同的，从而可以将11种多胞质系区分开来［12］。但研究特用玉米(甜玉米、糯玉米)和普通玉米的亲缘关系还较少，本文用聚丙烯酰胺电泳技术对玉米幼苗进行了过氧化物同工酶分析，采用计算联合系数的方法，鉴定了10个玉米品种间的亲缘关系。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以中国选育并审定登记的10个玉米品种为供试材料，其编号分别为Y1:赣新花糯1号;Y2:豫禾988;Y3:渝彩甜糯1号;Y4:台湾超甜38号;Y5:滑玉12;Y6:美糯2号;Y7:张玉9号;Y8:洛阳800;Y9:沈单16;Y10:鲁单981。

1.2 试验方法

1.2.1 酶液制备

取10个玉米品种的种子各20粒，分别播种于沙床，培养至长出2片幼叶，每品种分别称取幼叶各0.1 g，加0.3 mL提取液(0.2 mol/L的PBS，pH 7.0)，置冰浴中研磨至匀浆，4℃、10 000 r/min离心15 min，取上清液置－4℃冰箱中贮存备用。

1.2.2 制胶及电泳

制胶时所用的分离胶质量分数为7.5%(pH 8.9)，浓缩胶质量分数为4%(pH 6.8)。电极缓冲液为Tris-Gly系统(pH 8.3)，指示剂为溴酚蓝，点样量为30μL，开始稳压100～150 V，当溴酚蓝进入分离胶和浓缩胶交界处时，电压加大到200～250 V，低温电泳约4 h。

1.2.3 染色

过氧化物同工酶染色液［13］:5 mL的2%联苯胺醋酸溶液(2 g联苯胺溶于18 mL冰乙酸中，加水72 mL)和2 mL的3%H2O2，加蒸馏水93 mL。

电泳完毕取下凝胶置于染色液中染色5～10 min，待酶带清晰可见后用蒸馏水漂洗后观察结果并照相记录。

2 结果与分析

2.1 10个玉米品种间过氧化物同工酶分析

按相对迁移率Rf值绘制模式图并标定酶带位置。Rf=酶带移动的距离/前沿指示剂(溴酚蓝)移动的距离。经电泳分析供试的10个玉米品种的过氧化物同工酶酶谱可以归为若干酶谱类型，将所有的酶谱排在一起，总共分离出36条酶带，按其电泳迁移率(Rf)集中程度由负极向正极可分为A、B、C三个区，各品种的过氧化物同工酶酶带数为2～ 6条，迁移率在0.075～0.457之间变化(见图1)。其中，A区为近阴极端的慢速迁移区，Rf=0.075;B区为中速迁移区，Rf=0.161～0.226;C区为近阳极端的快速迁移区，Rf=0.441～0.457。从10个品种间酶带来看，Y1、Y2、Y5和Y7的酶带大致相同，都只有3条带，位置相同，但酶带活性各异。Y3和Y6的酶带数相同，位置也一样，酶带活性有差别。酶带数最多的品种是Y8和Y9，都是6条酶带，酶带位置都相同，仅在活性方面有差别。酶带数最少的是Y4和Y10，均只有2条酶带。

图1 玉米10个品种间过氧化物同工酶模式图

从表1可知:10个玉米品种间过氧化物同工酶酶谱也具有一定的差异，主要表现在酶带数、酶带迁移率与酶活性上面。A、B、C三个区都有各自的公共带，其中A区的公共带Rf=0.075，B区的公共带Rf=0.161，C区的公共带Rf=0.441。

表1 玉米10个品种间过氧化物同工酶相对迁移率(Rf)

2.2 10个玉米品种间亲缘关系的分析

玉米品种间亲缘关系的分析主要是通过任何两个玉米品种间联合系数(S)的比较得出，联合系数的数值大小直接反映出亲缘关系的远近。根据任何2个品种同工酶酶谱的条带估算，可得出任何2个玉米品种之间的联合系数(S)［14］。S=(两个品种之间共有的酶带)/［(两个品种所具有的酶带数之和)－(共有的酶带数)］，联合系数在0～1之间，联合系数愈小，说明两个品种间亲缘关系愈远。

从表2可看出:Y4和Y8、Y9之间以及Y10和Y8、Y9之间过氧化物同工酶的联合系数(S)都最小，均为0.333，说明它们的亲缘关系较远。

Y1和Y2、Y5、Y7之间过氧化物酶同工酶的联合系数为1.000，说明它们之间的亲缘关系较近;Y4和Y10之间过氧化物酶同工酶的联合系数为1.000，说明它们的亲缘关系较近;Y8和Y9之间的过氧化物酶同工酶的联合系数也为1.000，可见二者的亲缘关系也十分相近。其余品种的亲缘关系，通过过氧化物酶同工酶的联合系数得出，联合系数越小，品种间的差异越大，亲缘关系越远。

表2 玉米10个品种间过氧化物酶同工酶的联合系数(S)

3 结论

通过对10个玉米品种的过氧化物同工酶酶谱分析，总共分离出36条酶带，按其电泳迁移率(Rf)集中程度由负极向正极可分为A、B、C三个区。其中，A区的公共带Rf=0.075;B区的公共带Rf=0.161; C区的公共带Rf=0.441。各品种的过氧化物同工酶酶带数为2～6条，迁移率在0.075～0.457之间变化。对10个玉米品种亲缘关系进行分析，并研究它们的遗传相似程度，研究发现台湾超甜38号与洛阳800、沈单16的亲缘关系最远，而滑玉12与张玉9号的亲缘关系比较近，洛阳800与沈单16具有非常近的亲缘关系。

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