刘红霞 冯国开 杜 静 郭晓华 黄巧冰

南方医科大学基础医学院病理生理教研室

RhoA-ROCK介导的Moesin磷酸化对晚期糖基化终产物诱导的内皮细胞形态和功能改变的调节作用

刘红霞 冯国开 杜 静 郭晓华 黄巧冰

南方医科大学基础医学院病理生理教研室

目的：验证Rho A／ROCK信号通路参与晚期糖基化终产物（AGE）引起的膜突蛋白（Moesin）磷酸化，ROCK通过与Moesin直接作用导致Moesin磷酸化，探讨AGE引起Moesin磷酸化的位点及其生物学效应。方法：选用Rho A显性负效突变体（Rho AN19）和组成型活性突变体（Rho AL63）的重组腺病毒感染细胞，应用G-LISA试剂盒及免疫印迹法检测Rho A活性及ROCK、Moesin磷酸化水平，并采用ROCK抑制剂处理细胞，明确Rho A／ROCK通路是否参与AGE介导的Moesin磷酸化；通过免疫共沉淀方法检测ROCK与Moesin的相互作用，了解ROCK引起Moesin磷酸化的方式；通过分子克隆及体外定点突变技术构建Moesin的真核表达质粒pcDNA3／HA-Moesin及其突变体pcDNA3／HA-Moesin T558A 和pcDNA3／HA-Moesin T558D，经脂质体转染内皮细胞，运用免疫印迹、单层内皮细胞通透性测定及内皮细胞骨架纤维状肌动蛋白（F-actin）形态和定位检测，查明在AGEs诱导下的Moesin磷酸化位点。结果：AGE以时间和剂量依赖方式引起内皮细胞Rho A活性增高，改变Rho A活性，可以影响ROCK及Moesin的磷酸化水平；使用ROCK抑制剂，可减少Moesin磷酸化。ROCK通过直接与Moesin相互作用，导致Moesin磷酸化。用丙氨酸替代Moesin的558位苏氨酸抑制型突变体（pcDNA3-HA-Moesin T558A）可以降低AGEs引起的Moesin磷酸化水平、内皮细胞通透性，并改善AGEs引起的F-actin重排。而用天冬氨酸替代558位苏氨酸的激活型突变体（pc DNA3-HA-Moesin T558D）可以模拟AGEs引起的Moesin磷酸化水平、内皮细胞通透性及F—actin重排。结论：AGE通过激活Rho A活性进而导致其下游靶分子ROCK磷酸化，并通过直接与Moesin蛋白相互作用导致其磷酸化激活，进而引起内皮细胞形态和功能的改变。AGE引起Moesin蛋白活化的位点为第558位苏氨酸磷酸化位点（T558），抑制T558位点磷酸化可改善AGEs诱导的内皮细胞形态与功能的改变。

本课题为国家自然科学基金No.30771028；教育部创新团队项目No.IRT0730