毛跟年,李 鑫,瞿建波

陕西科技大学生命科学与工程学院,西安 710021

乙醛脱氢酶及其医疗领域研究进展

毛跟年＊,李 鑫,瞿建波

陕西科技大学生命科学与工程学院,西安 710021

对乙醛脱氢酶的种类、基本特性、制备、检测及其在医疗领域中应用作了简要的概述,旨在为该酶的进一步研究提供参考。

乙醛脱氢酶;性质;临床应用

Abstract:This article reviews the types,basic characteristics,preparation,testing,and application in the medical field of aldehyde dehydrogenase.In order to provide some references for its advanced research.

Key words:aldehyde dehydrogenase;characteristics;clinical

乙醛脱氢酶 (aldehyde dehydrogenase,ALDH)广泛存在于真核生物和原核生物中,在辅酶 I存在的条件下,它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应[1]。在人类和其他许多动物体内,线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化,所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注[2];同时,乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面也多有应用。因此,乙醛脱氢酶的研究具有重要的理论意义和应用价值。文中从乙醛脱氢酶的种类、性质、结构、制备、酶活测定及其在医疗领域的应用几个方面综述了乙醛脱氢酶的研究进展。

1 乙醛脱氢酶的种类

乙醛脱氢酶家族 (ALDHs)是一系列氧化各式各样脂肪族醛、芳香族醛为相应酸的酶[3]。哺乳动物乙醛脱氢酶根据其亚细胞所在位置、结构与动力学特性和原始序列的相似性可以分为三类[4]。第一类是细胞质的 (ALDH1),第二类是线粒体的 (ALDH2),第三类则是可诱导性的细胞质的乙醛脱氢酶和可诱导性的微粒体的乙醛脱氢酶 (如 ALDH3)。目前,对前两类乙醛脱氢酶进行了广泛的研究,并发现其有效促使短链脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比较之下对第三类乙醛脱氢酶的研究较少特别是对微粒体乙醛脱氢酶的研究,大鼠肝脏、兔子肠道、人类肝脏和人白血细胞中都发现了微粒体乙醛脱氢酶的存在[1],但作用机制尚不明确。

2 人类乙醛脱氢酶性质和结构

人体乙醛脱氢酶为多肽四聚体,根据四元结构和其他生化特征,至少有 7种不同基因编码 ALDH(ALDH1、ALDH2……ALDH7),但根据底物特异性和亚单位组成,只有 ALDH1和 ALDH2才被认为是“真”ALDHs,为人体肝内的两种主要同工酶,他们的基因分别位于 9号和 12号染色体。ALDH2位于线粒体内,而 ALDH1、ALDH3、ALDH4位于胞液内。ALDH1和 ALDH2为纯四聚体,由分子量为 54000的亚单位组成,含 500-501个氨基酸,他们的氨基序列中 68%是相同的[5],并且具有相类似的三维立体结构[6-8]。人类红细胞含有一种 ALDH,和肝细胞液内的 ALDH1相同。ALDH2表现出遗传多态性,ALDH2缺乏者有一个或两个等位基因突变,形成纯合子或杂合子,为常染色体显性遗传。突变的非典型ALDH2基因形成功能丧失的酶即非典型杂四聚体酶 (aaab、aabb、abbb、b表示非典型亚单位 )和非典型纯四聚体 (bbbb),不能有效代谢乙醛。

3 乙醛脱氢酶的制备

目前,天然的 ALDH难以获得,大多是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中提取,其资源有限且价格昂贵,因此很难大规模生产,为了拓展 ALDH的来源,科学家们探索从微生物中提取 ALDH。国外在此方面做了大量工作,早在上个世纪 70年代,Keith A.Bostian[9]就对从酿酒酵母中提取 ALDH进行了研究。国内吴桂英等[10]报道了从破碎酵母细胞提取 ALDH的新工艺,考察了自溶、反复冻融、超声波和高压破碎仪的细胞破碎方法对释放 ALDH的影响;周百灵等[11]利用超声波破碎、硫酸铵分级盐析以及 DEAE-32阴离子交换层析等方法提取了酿酒酵母胞浆内的 ALDH并对其酶学性质进行了研究,这就为酶的获得提供了宝贵资料。

在探讨从微生物中提取乙醛脱氢酶的同时,学者们还通过对菌种定向诱变和培养基优化提高微生物的酶产量。刘清利[12]等通过紫外线和 He-Ne激光诱变醋酸菌,选育出 1株乙醛脱氢酶高产菌株Z07-J01,该正突变 24 h发酵酶活为 1008.00 U/g湿菌体,比出发株提高了 276%,且酶活在 10代内稳定;王红波[13]等通过单因素试验和正交试验,对巴氏醋杆菌产乙醛脱氢酶的发酵培养基进行了优化,确定了培养基的最适条件和组分,提高了发酵培养生物量和产酶酶活;吴桂英[14]等人还对对酶学性质及发酵条件也进行了初步的研究,得到酿酒酵母产乙醛脱氢酶的最优发酵条件。

4 乙醛脱氢酶的测定

乙醛脱氢酶的测定可以采用多种不同的体系,常用的ALDH酶活测定采用脱氢酶酶活测定的方法。酶、辅酶 NAD+和底物在一定温度和 pH的条件下反应,通过每分钟波长 340 nm处吸光度值的变化,可以算出每分钟 NAD+转化为 NADH的量,从而得到该酶酶活[15]。一般定义每分钟波长 340 nm处吸光度值变化 0.001为一个活力单位 (U)。常用的检测体系有 O K IB E[16]的 3 mL反应体系;Keirh A.Bostian的 2.5ml检测体系等。

5 乙醛脱氢酶在医疗领域的应用研究

5.1 乙醛脱氢酶与酒精中毒

各种酒类都含有乙醇,可引起饮酒后脸红、心跳加速、皮肤加热、血压升高的急性酒精中毒症状,但这主要不是由于血液中乙醇浓度的升高,而是由于血液中乙醛浓度的升高造成的;研究表明[17],乙醛具有强烈的毒理作用,可刺激肾上腺素、去甲肾上腺素等物质的分泌,引起面红耳赤、心率快、皮温高等症状。而人类对酒精耐受性有种族的和个体的差异,黄种人中 80%为酒精敏感者,白种人中仅 5%为酒精敏感者。大多数黄种人在饮酒后产生乙醛速度快,而氧化为乙酸的速度慢,故易产生乙醛蓄积中毒[18]。也就是说,乙醛脱氢酶的不足使乙醛在体内积累导致中毒现象,乙醛对引起急性酒精中毒症状比乙醇起更重要的作用。解酒重在加速乙醛的分解,使之产生乙酸,进一步分解为 CO2和 H2O,而在此过程中乙醛脱氢酶的作用尤为重要。

5.2 乙醛脱氢酶与肝损伤

乙醛可以作为高活性物质,与乙醇性肝损伤的发展密切相关。肝细胞线粒体内的乙醛可被 ALDH氧化为乙酸,当 ALDH活性降低时,未被氧化的乙醛进入血内,通过黄嘌呤氧化酶转变为超氧化物,进而导致膜脂质过氧化,丙二醛和壬烯是 2个强毒力的脂质过氧化终产物,常作为判断脂质过氧化的指标。他们可进一步促进枯否细胞和肝细胞释放细胞因子,破坏细胞膜,最终促进肝损伤[19]。同时,Surrenti[20]等还观察到 ALDH活性的减弱与肝损伤的程度是平行发展的。

5.3 乙醛脱氢酶与心血管疾病

乙醛脱氢酶 2(ALDH2)是线粒体内一种重要的醛类氧化酶,在心血管疾病的发生、发展过程中发挥重要作用。ALDH2野生型能够抑制心肌细胞凋亡发挥心肌保护作用[21],是心力衰竭和心肌病的保护因子。ALDH2还是体内重要的氧化应激分子,ALDH2野生型能够减少体内的氧化应激,减缓动脉粥样硬化进展[22];增加斑块的稳定性,减少心肌梗死。提高ALDH2活性有望成为心血管疾病治疗的突破点。

5.4 乙醛脱氢酶与神经系统

人类神经 tau蛋白具有稳定细胞微管系统、调控神经细胞生长发育的功能[23],并在神经系统的形成和轴突的通讯传导中起着至关重要的作用[24]。tau是一种磷酸化蛋白,其功能主要通过磷酸化调节。超磷酸化可导致 tau蛋白分子的聚集,形成配对螺旋样纤维[25],这是老年性痴呆在病理学上的基本病变之一。乙醛可能使 tau分子错折叠而产生超磷酸化,华茜,聂春来等[26]用乙醛对人类神经 tau进行醛胺化,通过 NCLK(neuronal cdc2-like protein kinase)和 [γ-32P]ATP对其磷酸化,磷酸化的产物经胃蛋白酶降解及 HPLC(C-18)分析降解片段,发现醛胺化 tau的降解物中有两个新的磷酸化肽段(A4和 A6)。可见及时降解体内的乙醛显得尤为重要,而开发乙醛脱氢酶类蛋白质药物,不失为一种好的选择。

5.5 乙醛脱氢酶与肿瘤

长期的大量摄入乙醇会增加上消化道癌 (口腔、咽、喉和食道)、胃癌以及直肠癌的发病率。研究表明乙醛有直接的诱变和致癌性。乙醛可使得DNA发生点突变,从而诱导姐妹染色单体交换和染色体异常[27]。乙醛导致 DNA复制异常和削弱修复作用的一个机制就是形成稳定的 DNA络合物[28]。有很多流行病学研究已经证实,携带 ALDH2＊2等位基因的亚洲人因酗酒引发消化道癌症的几率明显较大:胃癌、结肠癌、肺癌为 3～10倍;咽癌、食道癌为 11～15倍[29];而食道癌、咽癌和肺癌同时发病的几率增加了 50倍。

5.6 乙醛脱氢酶在生理代谢方面的研究

乙醛可以共价地与微粒体蛋白结合形成乙醛蛋白络合物。后者可以作为新抗原刺激机体引起相应的免疫应答,导致肝细胞损伤。乙醛可以与酶的重要功能基团结合,导致酶活性改变,影响酶的功能。乙醛还可以与细胞内微管中的管蛋白结合。微管的重要功能之一就是促进蛋白质的细胞内转运和分泌,肝内蛋白质分泌障碍,导致蛋白质在肝内滞留,引起肝细胞损伤。早期乙醇性肝纤维化和肝硬化形成过程中,肝星形细胞活化,导致肝星形细胞中的 I型胶原和纤维连接蛋白基因增加,从而引起细胞外基质在肝内沉积,肝纤维化形成[19,20]。

同时,乙醛可与体内一些蛋白质、磷脂、核酸等呈共价键结合,形成稳定的加合物。ALDH的生理意义在于它对乙醛的解毒作用。乙醛在肝脏和其他器官内的氧化由 NAD+-依赖性 ALDH催化,酶促反应是不可逆的,它以直链和支链的脂肪族和芳香族醛作为底物,产生对应的酮酸[30]。

5.7 乙醛脱氢酶在临床研究上应用

2007年 Ginestier[31]等发现 ALDH1是乳腺癌干细胞的标记物,此后,在白血病,视网膜母细胞瘤等多种肿瘤干细胞中均发现有ALDH1表达[32,33],ALDH1能氧化环磷酰胺的中间代谢产物醛磷酰胺,形成无毒的羧基磷酰胺,从而发挥对 CTX的解毒作用[34],而且细胞中 ALDH1水平可以用来预测环磷酰胺治疗的疗效,由于ALDH1的解毒作用导致肿瘤对环磷酰胺的耐药。另有研究表明,经化疗后的结直肠癌组织中肿瘤干细胞有 ALDH1的表达[35]。

国内研究中,周凌,虞佩等[36]采用免疫组织化学染色法检测 92例乳腺癌患者肿瘤组织中 ALDH1蛋白的表达,并结合临床病理特性进行相关性分析和无病生存期分析,结果表明ALDH1蛋白表达阳性的乳腺癌患者其无病生存率与耐药有关,ALDH1可作为乳腺癌预后判断的指标,可用于鉴别乳腺癌组织中的“类干细胞”群落;潘兆军,江志敏等[37]研究发现ALDH1在结肠癌组织中有一定高表达率,其高表达提示预后不良,可作为评价结肠癌预后指标,促进肿瘤干细胞的临床实践。

另有研究发现,乙醛脱氢酶在活的造血干 /祖细胞 (HSPC)中高表达,乙醛脱氢酶活性检测可以作为检测脐带血中 HSPC的一个有用指标[38],拓宽了其应用领域。

6 结语

近年来,随着生物技术日新月异的发展,对乙醛脱氢酶的研究越来越深入,研究了该酶的基因多态性、分子结构、理化性质,报道了该酶的诱导剂、激活剂、抑制剂,并对该酶分离提纯,还通过基因工程将该酶基因表达在大肠杆菌和植物体内。但研究较多集中在乙醛脱氢酶的分离提取、基因多态性以及其与疾病的相关性方面,并未见将乙醛脱氢酶制成预防和治疗各种相关疾病 (像酒精性疾病)的药品或保健品的报道,也未见其在工业上应用的报道。

由于ALDH的广泛作用,它必将受到研究者的日益关注。随着新的分离纯化技术出现,ALDH将会得到更好的分离,届时它的用武之地将会大大扩展。

1 Todd L Kelson,et al.Human liver fatty aldehyde dehydrogenase:microsomal localization,purification,and biochemical characterization.Biochim Biophys Acta,1997,1335:99-110.

2 Kwan-Hoon Moon,et al.Inactivation of cytosolic aldehyde dehydrogenase via S-nitrosylation in ethanol-exposed rat liver.FEBS Letters,2007,581:3967-3972.

3 Yoshida A,et al.Human aldehydrogenase gene family.Eur J B iochem,1998,251:549-557.

4 Qiao HL(乔海灵).Clinical Pha rmacology,1st Ed.Zhengzhou:Zhengzhou university Press,2004.117-118.

5 Hempel J,et al.Aldehyde dehydrogenase.A lcohol,1993,25:105-116.

6 Steinmetz CG,et al.Structure of mitochondrial aldehyde dehydrogenase:the genetic component of ethanol aversion.Structure,1997,5:701-711.

7 Moore SA,et al.Sheep liver cytosolic aldehyde dehydrogenase:the structure reveals the basis foe the retinal specificity of class 1 aldehydes dehydrogenase.Structure,1998,6:1541-1551.

8 NiL,et al.Human livermitochondrial aldehyde dehydrogenase:three-d imensional structure and the restoration of solubility and activity and activity of chimeric forms.Protein Sci,1999,8:2784-2790.

9 Keith A Bostian,Grahaham F Betts.Rapid purification and properties of potassium-activated aldehyde dehydrogenase from Saccharomyces cerevisiae.Bioche mical J,1978,173:773-786.

10 Wu GY(吴桂英),et al.Study on aldehyde dehydrogenase release by breaking yeast cells.Liquor-making Science&Technology,2006,(11):21-23.

11 Zhou BL(周百灵),et al.Extraction of and research on cytosolic aldehyde dehydrogenase fromSaccharo myces cerevisiae.Liquor-making Sci Technol,2009,(6):28-30.

12 Liu QL(刘清利),et al.Breeding acetobactermutants producing aldehyde dehydrogenase and enzymatic properties.Acta Agric Boreali-occid Sin,2006,15:251-254.

13 Wang HB(王红波),et al.Optimization of cultivation media ofAcetobacter pasteurianus for acetaldehyde dehydrogenase.Food Sci Technol,2009,34(5):6-9.

14 Wu GY(吴桂英),et al.Study on the fe rmentation conditions for aldehyde dehydrogenase production bySaccharom yces cerevisiae.Liquor-making Sci Technol,2009,(5):40-41.

15 Brunq Stellmach.Qian JY(钱嘉渊)(translation).Bestimmungsmethoden Enzyme.Beijing:ChinaLightIndustry Press,1992.36.

16 OK IB E N,et al.Gene cloning and characterization of aldehyde dehydrogenase from a petroleum-degrading bacterium Strain HD-1.J B iosci B ioeng,1999,88:7-11.

17 Crabb DW,et al.Genotype for aldehyde dehydrogenase deficiency and alcohol sensitivity.J Clin Invest,1989,83:314-316.

18 YangBS(杨保胜).et al.Medical Genetics and Reproductive Sciences.Zhengzhou:Zhengzhou University Press,2008.322.

19 Luo HR,Zhang YP.Aldehyde dehydrogenase(ALDH2)polymor phism and drinking behavior.Int J Mol Med,2000,6:455-457.

20 Surrenti C,Galli M.Molecular mechanisms of alcohol-induced liver injury.Minerva GastroenterolD ietol,2003,49:95-105.

21 Sun AJ,et al.Proteomic analysis of myocardial mitochondria in rats with heart faikure.Cardiovasc D rugs Ther,2004,18(1):21.

22 NaritaM,et al.Effects of aldehydrogenase genotypes on carotid atherosclerosis.U ltrasound Med B iol,2003,29:1415-1419.

23 Drechsel DN,et al.Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.Mol Biol Cell,1992,3:1141-1154.

24 Brion JP,et al.Both adult and juvenile tau microtubule-associated proteins are axon specific in the developing and adult rat cerebellum.Neurosci,1988,25:139-146.

25 Beyreuther K,Masters CL.Alzheimers disease-tangle disentanglement.Nature,1996,383:476-477.

26 Hua Q(华茜),et al.Effect of acetaldehyde on phosphorylation of human neuronal tau.Prog B iochen B iophys,2001,28:761-763.

27 Dellarco VL.A mutagenicity assessmentof acetaldehyde.Mutat Res,1988,195:255-262.

28 Fang J I,Aca CE.Detection of DNA adducts of acetaldehyde in peripheral white blood cells of alcohol abusers.Carcinogenesis,1997,18:627-632.

29 Yokoyama A,et al,Alcohol-related cancers and aldehyde dehydrogenase 3 Japanese alcoholics.Carcinogenesis,1998,8:1383-1387.

30 Zhou HH(周宏灏).Genetic Pharmacology.Beijing:Science Press,2001.206.

31 Ginestier C,et al.ALDH1 is a marker of normal and malignant.human mammary stem cells and predictor of poor clinical outcome.Cell Stem Cell,2007,1:555-567.

32 MagniM,et a.lInduction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde dehydrogenase gene transfer.B lood,1996,87:1097-1103.

33 MagniM,et a.lInduction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde-dehydrogenase gene transfer.B lood,1996,87:1097-1103.

34 Yanagawa Y,et al.The transcriptional regulation of human aldhyde dehydrogenase I gene.The structural and functional analysis of the promoter.J B iol Chem,1995,270:17521-17527.

35 Dylla SJ,et al.Colorectal cancer stem cells are enriched in xenogeneictumors following chemotherapy.PLOS ONE,2008,3(6):24-28.

36 Zhou L(周凌),et al.Expression of aldehyde dehydrogenase1 in breast cancer and its clinical significance.Tum or,2009,29:663-667.

37 Pan ZJ(潘兆军),et al.Expression ofALDH1 and its significance in colon cancer.Chin Gen Surg,2009,3:19-21.38 LiL(李莉 ),et al.The application of acetaldehyde dehydrogenase in detection of cord blood haemopoietic stem/progenitor cells.B ioMed Eng Clin Med,2009,13:324-327.

Research Progress of Aldehyde Dehydrogenase

MAO Gen-nian＊,L IXin,QU Jian-bo
College of life Science&Engineering,Shanxi University of Science&Technology,Xi'an,710021,China

R284.2

A

1001-6880(2011)01-0193-05

2010-03-16 接受日期:2010-06-17

陕西省自然科学基金项目 (SJ08B18);陕西省教育厅专项科研计划项目 (编号 08JK236)

＊通讯作者 E-mail:maogn@sust.edu.cn