张立会,王宏宇,刘红燕,聂建国

（1.吉林大学第二医院,吉林 长春 130041;2.根河市满归中心卫生院,内蒙古根河 022363）

卵巢恶性肿瘤发生率在女性生殖系统肿瘤中占第3位,低于宫颈癌和子宫体癌,但死亡率却最高。其中40%-50%为卵巢浆液性囊腺癌（Ovary serous cystadenocarcinoma,OSC）,最为常见。由于卵巢位置深在盆腔,早期症状不典型或无明显症状,且缺乏早期有效可靠的诊断、治疗及预后评价方法,这就使得卵巢癌的早期诊断率不高,70%的患者初诊时已是晚期,预后差,5年生存率仅为20%左右;而在早期发现者经过常规手术和化疗,5年生存率可达90%。因此,筛选特异、敏感的肿瘤标志物对卵巢癌的早期诊断和预后具有重要意义。

蛋白质组是指一个细胞、组织或机体的基因组所表达的所有蛋白质。蛋白质组学是对蛋白质组整体水平进行研究的一门新型技术。蛋白质组学（proteomics）技术已达到细胞及亚细胞器蛋白质组分析水平,可彻底阐明细胞所有的蛋白质组分。使寻找用于临床早期诊断的特异敏感的生物学标志物成为可能[1]。在卵巢癌的多方面研究中得到广泛的应用,如对卵巢癌发病机制的研究、卵巢癌肿瘤标志物（tumor marker,TM）的筛选、卵巢癌信号转导通路的研究及协助诊断、协助卵巢癌分类、寻找治疗靶点等。研究卵巢癌的发病机制、分类、治疗方法,尤其是早期诊断（early diagnosis）,具有十分重要的意义,而与传统方法相比,蛋白质组学在肿瘤各方面研究中具有十分独特的优势。

1 材料与方法

1.1 病例选择 本研究选取吉林大学第二医院妇科2008年4月-2008年12月收治的临床上初次手术治疗并经病理确诊的卵巢浆液性囊腺癌患者6例（以下称CA组）,卵巢交界性浆液性囊腺瘤6例（以下称IN组）,已告知患者取组织学标本用途,并同意取材。手术标本均在30分钟内置于-80℃低温冰箱内保存。CA组年龄范围为42-75岁,病理类型均为卵巢浆液性囊腺癌,临床病理分期均为IIIc期。

1.2 实验方法 把保存好的标本融化,放在无菌的培养皿中用磷酸盐缓冲液冲洗,去除黏附的血红蛋白和其他蛋白。然后把组织切成1mm3大小,放入液氮中研磨粉碎。再用裂解液溶解,同时加入DNA酶和RNA酶去除DNA和RNA。然后在100,000 g条件下离心1小时去不溶解成分。所有样品用Bradford方法测定蛋白浓度后置-80℃保存。酶切前所有样品用25mM NH4HCO3稀释使尿素浓度低于2M。酶切时首先用20mM DTT在56℃条件下还原1小时,再在常温下避光用50mM碘乙酰胺烷基化30分钟,然后按 1∶50比例加入测序级胰酶37℃酶切过夜。酶切后样品真空抽干后-80℃保存备用。所有样品用缓冲液A（0.1%甲酸）溶解后,应用二维液质联用技术（two dimensional liquid chromatography mass Spectrometer/mass Spectrometer,2-DE LC-MS/MS）进行分析,每次实验上样量为50μg。强阳离子柱为150mm×0.32mm,反相柱为150mm×0.17mm,强阳离子柱的乙酸氨洗脱方法为12.5mM,25mM,50mM,75 mM,250mM和5M。反相柱洗脱方法为5-30%缓冲液B（0.1%甲酸,99.9%乙腈,流速为2 μL/m in）,洗脱时间为3小时。每个样品做两次实验。经反相色谱洗脱的多肽应用LTQ XL质谱仪检测,质核比检测范围为400-2000 amu,应用数据依赖方式进行次二级质谱扫描（每次全扫描后做10次二级扫描,母离子质核比宽度为3 amu,35%标准碰撞能量,动态排除时间为1.5min）。

1.3 数据处理 强度在10个单位以上、有10个以上离子信号的谱图用SEQUEST算法和相关Bioworks 3.3.1 SP1软件包进行数据库检索,鉴定出相关多肽和蛋白。蛋白数据库为从欧洲生物信息学院网站（http://www.ebi.ac.uk/IPI/）下载的人蛋白质数据库（3.58版）。相关检索参数如下:多肽质量误差范围为3 Da,半胱氨酸修饰为+57,完全酶切肽段,可以有两个误切位点。SEQUEST检索后筛选参数如下:（1）Rsp=1;（2）在假阳性率为1%时,DeltaCn＞=0.2,Xcorr值在单电荷时为1.7,双电荷时为3.2,三电荷时为3.3。

1.4 结果判定 本研究应用两次实验中每个蛋白的谱图数来评价其丰度。对于在不同样品中丰度发生变化的蛋白,其谱图数变化必须满足以下原则:（1）两个样品中谱图数的比值大于等于2。（2）两个样品中谱图数的差值大于等于24（平均每次实验差值为12）。为评价上述方法用于鉴别蛋白丰度变化的假阳性率,每个样品的两次实验之间进行了相互比较分析,相应假阳性率为1.4%。

2 结果

2.1 1D-PAGE结果 将为CA组、IN组的混合样品酶切前后分别进行1D-PAGE（如图1）,得出结果两组间及酶切前后电泳条带均有有差异,一方面说明这两个样品是有差异的,另一方面说明本酶切效率比较好,酶切后的肽段都在分子量10 KD以下。对酶切后样品进行液质联用图谱分析。

图1 CA组、IN组的混合样品酶切前后1D-PAGE结果

2.2 质谱分析结果 从CA组、IN组的组织标本取得的2个混合样品,液质联用分析都进两次实验。综合两次实验结果,CA组织蛋白共计1 085个;IN组织蛋白共计585个。两次实验得出的谱图数是相近的,说明本方法具有很好的重复性。根据差异蛋白判定原则,计算得出CA-IN组差异蛋白数为96个。

CA-IN组鉴定得出的96个差异蛋白谱中,有83个差异蛋白表达上调;13个差异蛋白表达下调。这些差异蛋白主要包括细胞骨架蛋白、伴侣蛋白、细胞外基质蛋白、参与物质及能量代谢的酶类、信号转导、细胞周期、转录及翻译相关蛋白、免疫调节因子以及其他参与卵巢癌发生、发展、转移相关蛋白。蛋白分类构成情况如图2。

其中16个蛋白为细胞骨架成分,12个蛋白为伴侣蛋白,12个蛋白为细胞外基质的组成成分,25个为参与物质及能量代谢的酶类,3个参与信号转导的蛋白分子,18个参与细胞周期、转录及翻译相关蛋白,4个免疫相关蛋白以及其他6种蛋白质。

3 讨论

由于卵巢癌早期缺乏特异的临床表现和有效的筛查方法,I期就明确诊断的患者仅仅占25%。因此卵巢癌的早期诊断在提高卵巢癌患者生存率上显得尤为重要。

目前CA125是应用最为广泛的上皮性卵巢癌检测标志物,在晚期上皮性卵巢癌中阳性率可达80%,但Ⅰ期卵巢癌患者仅50%-60%,单测CA125时其阳性预测值＜10%,辅助超声检测只有20%左右,因此不能用于卵巢癌早期诊断的常规筛查。

本实验采用二维液质联用技术鉴定了6例卵巢浆液性囊腺癌和6例卵巢交界性浆液性囊腺瘤组织的差异表达蛋白质谱。为了降低实验的假阳性率,两个实验样品分别做两次,综合两次实验结果,根据差异蛋白的判定原则鉴定出96个唯一/成组差异蛋白。按照蛋白功能不同分为8类,其中一些蛋白与卵巢癌和（或）其它恶性肿瘤的关系比较明确,参与细胞间或细胞内生物信号转导、免疫调节,促进肿瘤细胞的恶性增殖,加速肿瘤的发生、发展和转移,在肿瘤发生发展过程中在不同时相、部位起着重要的作用。尚有其他一些差异蛋白与卵巢癌的关系尚未明确。

图2 差异蛋白粉类构成

3.1 细胞骨架蛋白

细胞骨架是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构,由微丝、微管和中间纤维构成。本实验鉴定出3种肌动蛋白（胞质肌动蛋白、人肌动蛋白素-1、骨骼肌肌动蛋白-1）,参与细胞的有丝分裂、信号传导和细胞的运动,它的异常表达可能与肿瘤细胞的恶性增殖和侵袭有关[3]。7种微管蛋白链（微管蛋白 α-1A 、β 、β-2A 、β-2C 、β-3 、α-4A 、A1B cDNA FLJ60097）,是 中心体的重要组成部分,参与染色体的运动、有丝分裂和细胞凋亡等。tubulin A、B蛋白正常排列的破坏及表达异常与肿瘤的恶性生物学行为密切相关,其数量及形态在肿瘤细胞中均发生了变化,微管的聚合及解聚与恶性肿瘤的发生及增殖有关。2种网格蛋白（网格蛋白-1、网格蛋白重链-1）形成参与细胞内吞的包被外壳和主要支架。3种肌球蛋白（肌球蛋白14重链3亚型、肌球蛋白-9:1亚型、肌球蛋白11）,肌球蛋白在胞质分裂、细胞形态和某些功能如细胞分泌有重要作用,是决定细胞形态和功能的因素之一。

3.2 伴侣蛋白

是细胞受刺激后被诱导产生的一组应激蛋白。除热损伤外,能由多种损伤因素诱导,具有维持细胞蛋白自稳、调节细胞周期等多种重要功能。本实验鉴定出10种HSP分型,（HSPA5、HSP 71 kDa、HSPA1B;HSPA1A 70 kDa、HSP 27kDa 、HSP60 kDa、HSP90-beta、HSP90B1:内质网素、HSPA1L 70 kDa 、泛素样活化酶-1、缺氧上调蛋白1（Hypoxia up-regulated protein 1,HYOU1）。有证据表明HSP家族可能通过抑制细胞凋亡来导致肿瘤形成[4]。

HSP27是一种与致癌作用明显相关的HSP亚型,在多种恶性肿瘤中高度表达,包括生殖系统肿瘤。卵巢癌患者对Hsp27免疫应答增强。因此HSP27-抗HSP27抗体的凝集试验可能成为卵巢癌早期诊断的有用参数。HSP70在正常细胞中表达水平较低,而在应激状态下可显著性升高。在病毒转化和化学诱导的肿瘤细胞中,HSP70的表达显著升高;并且对细胞凋亡有保护作用,其高表达可增强肿瘤细胞抗凋亡能力。可提示上皮发育不良或恶变[4]。HSP90的抑制剂具有抗增殖和促进细胞凋亡的作用,有望成为癌症化疗药。HYOU1在局部缺氧缺血和血管形成中有重要作用,在侵袭性前列腺癌、膀胱癌和乳腺癌中表达增加,与淋巴管及淋巴结侵袭等因素有关,认为HYOU1可能在肿瘤转移中起作用,并可提示预后不良。PDI是一种胰脏特有的糖基化蛋白质,可导致蛋白质折叠错误。本实验鉴定出PDI的A3亚型PDIA3。PDIA3是一种恶性肿瘤高迁移率蛋白,参与DNA片段破坏,可能成为新的化疗药物靶点[5]。

此外,PHB基因可能是一种抑癌基因,具有抗增殖活性。Jean等[6]应用蛋白质组学技术在TOV-112D卵巢癌细胞系发现PHB呈高表达。

3.3 细胞外基质

细胞外基质（extracellu larmatrixc,ECM）是肿瘤转移的组织屏障。恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移常常伴有细胞外基质及其细胞表面受体表达的变化。

本实验鉴定出12种ECM类蛋白,其中胶原蛋白包括XIV型胶原蛋白α-1、VI型胶原蛋白α-3及它的3种前体。VI型胶原a-3的分布与肿瘤分化程度有关,随着分化程度的下降而减少,可能与肿瘤细胞通过蛋白水解酶降解基底膜有关。

糖蛋白在恶变细胞中,其结构或含量发生改变。

FN在子宫内膜癌中表达降低,与其侵袭、转移关系密切,有望成为子宫内膜癌进展指标[7]。FN分布与肿瘤分化程度有关,分化差的癌巢周围缺乏FN,可能与癌细胞分解基底膜有关。

VTN参与卵巢癌转移的起始阶段。VTN与整合素α（v）连接并相互作用促使卵巢癌细胞增殖及转移。VTN主要在肝脏合成,分布在正常卵巢上皮表面及分化的卵巢腺癌,在未分化腺癌组织中则不表达。VTN与肿瘤的侵袭与转移有关,并可能有助于病理分型。

CLU作为凋亡抑制因子,在许多肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。Hough等[8]应用cDNA芯片检测发现,卵巢癌细胞中Clu基因的mRNA表达明显上调,可能与卵巢癌的发生、发展相关。SPON1在卵巢癌上皮表达,而正常卵巢中无表达,认为是一种潜在诊断的卵巢癌肿瘤标记物和新的治疗靶点。

POSTN可能是一种有力的肿瘤促进剂,与其他基质蛋白协引起肿瘤发生。这一过程先于肿瘤发展,成为潜在的诊断早期肿瘤的标志物[9]。

FMOD使肿瘤间质增厚,增加细胞间隙液压。给肿瘤细胞与血液之间建立屏障。可成为靶向治疗的位点,提高实体恶性肿瘤化疗疗效。

DCN可以抑制多种组织来源的细胞生长。应用免疫组化法及WESTERN-BLOT法未在卵巢癌中检测到DCN,推测可能是在 DCN转录合成后被卵巢癌上皮细胞分泌酶类灭活[10]。

3.4 参与物质及能量代谢的酶类

本实验发现物质能量代谢相关蛋白共有25种,主要包括糖酵解酶类、电子转移的辅酶、合成蛋白质酶类、ATP合成水解酶和GTP合成水解酶、核酸代谢相关酶类等。这些酶类的高表达符合恶性肿瘤代谢特点,在肿瘤诊断及治疗方面有重要的作用。

Altenberg等[11]认为糖酵解途径相关基因在超过70%的人类肿瘤病例中过表达。糖酵解异常活跃是恶性肿瘤物质能量代谢的主要特征。

秒表时间研究法是一种最直接和较为可靠的研究工序作业时间的方法，就是用秒表对工序按照操作顺序进行测定，测得多个周期时间之后，再求平均时间，作为单个周期的时间。这其实是一种抽样法，就是用样本推测总体，所以，对于每个工序需要测量多少组数据，才能较为合理，这非常重要。这里主要介绍误差界限法：

其中线粒体苹果酸脱氢酶是三羧酸循环和天冬氨酸-苹果酸穿梭体的重要组成部分;三羧酸循环中的一些重要酶类可能作为药物的靶标,或用于发展疫苗。

本实验鉴定出2种与核酸代谢有关的蛋白质。包括DNA依赖蛋白激酶催化亚基、葡萄球菌核酶区包含蛋白。其中DNA依赖蛋白激酶催化亚基,具有DNA水解酶功能。

3.5 信号转导相关蛋白

粘液病毒抗性蛋白（Interferon-induced GTP-binding protein,Mx1）属于大GTP酶的动态蛋白超家族,是由STAT信号传导通路介导,由Ⅰ型IFN诱导的跨膜转运蛋白,具有广谱的抗病毒能力。SAMHD1具有跨膜结构。K-sam是成纤维细胞生长因子受体家族成员,50%弥漫型胃癌存在K-sam的过表达。弥漫型胃癌中K-sam基因扩增与肿瘤的进展和转移是有一定的联系[12]。STAT1除介导正常细胞信号传导外,在肿瘤的发生、发展中起着十分关键的作用。许多肿瘤STAT途径存在异常,导致细胞转化、凋亡抑制。

3.6 细胞周期、转录及翻译相关蛋白

我们鉴定出参与细胞周期、转录、翻译及调控的蛋白有18种。

组蛋白对染色质的组装和结构形成起到重要作用。本实验鉴定出7种组蛋白亚型。磷酸化组蛋白H2AX是DNA双链断裂的标志物[13],组蛋白H 1.3表达下调,它在染色质的包装和活化方面具有非常重要的作用,对转录具有抑制作用。抗磷酸化组蛋白-H 3抗体可标记细胞增殖分裂相;组蛋白类修饰与许多基因表达下调有关,其中包括很多在恶性肿瘤发生发展过程中起关键作用的基因。

过氧化物酶基因（peroxiredoxin-1,PRDX1）,参与基因转录调控及信号转导,是一种肿瘤抑制基因。

14-3-3蛋白（14-3-3 protein zeta/delta,YWHAZ）是一种衔接蛋白,Sinha[14]等应用双向电泳法研究耐药的人类黑素瘤细胞系,发现14-3-3蛋白δ的高表达干扰伴侣蛋白系统,影响转录机制,进一步研究有助于开发更有效的化疗药物。

本实验检测出4种EEF亚型:硫脲嘧啶-转运体线粒体前体、EEF1A1、EEF1B2和延长因子 2。其中硫脲嘧啶翻译延长因子在多种肿瘤中广泛存在并高度表达。CTSD是一种肽链内切酶,与多种恶性肿瘤的浸润和转移有密切关系。hn-RNPs可成为调节端粒长度的标靶[15]。核不均一核糖核蛋白M,核不均一核糖核蛋白C1/C2,在本实验中表达上调。其中hnRNPC1/C2是细胞核中含量最大的蛋白质之一,影响细胞增殖与分化。hnRNPM4,又被称为癌胚抗原受体,位于巨噬细胞膜于与癌胚抗原结合后通过激活信号转导途径逃避细胞凋亡。

3.7 免疫调节因子

免疫抑制及免疫逃避是恶性肿瘤的发病机制之一,也是肿瘤免疫疗法研究的热点。本实验发现4个免疫相关因子。

TAP1与鼻咽癌的发病有关。小剂量非复制腺病毒编码的TAP1可诱导T细胞记忆,进而对肿瘤进行免疫应答[16]。

GC属胞外射线清除系统,该蛋白存在于多种恶性肿瘤中,如乳腺癌,结肠癌,胰腺癌,前列腺癌等[17]。有研究认为该蛋白与绝经后妇女低乳腺癌风险有关。

A1BG属于免疫球蛋白超家族成员,是一种分泌血浆蛋白。Kreunin等人[18]使用糖蛋白检测方法,在膀胱癌病人的尿的样品中发现A1BG,但是在正常个体未检测到。A1BG是一个与肿瘤相关基因,可能是一种潜在的肿瘤标记物。

IGHV3是一种免疫球蛋白重链片段,其多态性与大疱性类天疱疮易感性有关。表达非突变状态IGHV的多毛细胞白血病对克拉屈滨呈低反应性,使病情恶化[19]。

3.8 其他肿瘤相关蛋白

A2M是一种血浆蛋白同时也是一种广谱的蛋白酶抑制剂。它具有抑制肿瘤生长参与出凝血平衡和清除循环中内源性及外源性蛋白水解酶等重要生理功能。

本实验鉴定出三种亚型FGA、FGB和FGG均表达上调。卵巢癌患者磷酸化FGA血清水平提高[20]。FGB可抑制内皮细胞对ECM的粘附,间接地抑制血管形成,推测其可能具有抗肿瘤效应。FGG同样具有抑制血管形成及肿瘤生长的功能。

综上所述,我们的实验将二维液质联用技术应用到卵巢癌的研究中,这一方法便利、高效、重复性好;在样品的选择上,卵巢浆液性囊腺癌组织与卵巢交界性浆液腺瘤组织进行对比,有望发现癌形成初始过程中关键的致癌因子,有利于卵巢癌发病机制的探索,特异性的卵巢癌肿瘤标志物筛选。研究结果表明:二维液质联用技术是有效可行的,将有助于我们简便快捷地筛选肿瘤标志物,可以从整体上阐述卵巢肿瘤发生发展过程中蛋白质的动态变化及相互作用网络,必将对探索卵巢癌的发病机制做出巨大贡献;应用于临床,对卵巢癌的诊断、治疗及预后评估有重要意义。

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