郝亚明,周 玉,卢士英,任洪林,李岩松,柳增善,刘文迪,宋 芳

（人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春 130062）

重金属对环境及人类存在潜在的持续的毒害作用,建立一种规范的程序,对重金属实施有效的监测[1]。传统的重金属检测方法多采用化学方法检测,如原子吸收光谱分析（atomic abs orption spectroscopy,AAS）、电感耦合等离子发射光谱（inductively coupled plasma atom ic emission spectroscopy,ICP-AES）等,这些方法需要大量的样品预处理,无法用于现场检测,费用高和检测时间长等缺陷,难以适应环境及市场产品的现场抽查[2]。免疫学检测具有检测速度快、费用低、仪器易携、灵敏度高和选择性强等优点。本研究通过制备重金属镉的单克隆抗体为镉免疫学检测奠定了基础。

1 材料

1.1 实验动物

Balb/c小白鼠,雌性,6-8周龄,购于长春生物制品研究所;SP2/0-Ag14小鼠骨髓瘤细胞,为本实验室保种传代。

1.2 试剂

牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin,BSA）、卵清白蛋白（Albumin Egg OVA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、二甲基亚砜（DMSO）:美国Sigma-Aldrich公司;l-（4-硫氰根苄基）乙二胺四乙酸（1-（4-Isothiocyanobenzyl）ethylenediamine N,N,N',N'-tetraacetic acid,ITCBE）:日本同仁化学研究所;氯化镉（CdCl2·2H2OCadm ium Chloride AR）:国药集团化学试剂有限公司。

2 方法

2.1 镉离子完全抗原的制备

称取4.0mg BSA溶于4.0ml硼酸盐缓冲（0.01 M pH 9.0）中,缓慢滴加2 mg ITCBE（溶于200m l DMSO中）,边滴加边震荡,于25℃,100 r/min的摇床中作用24 h,用透析袋（截留分子量14 000）进行透析,去除未与 BSA结合的 ITCBE,得 ITCBE-BSA。ITCBE-BSA溶液用1M的HCl调节pH值至7.0,再缓慢逐滴滴加100μl10mM的CdCl2溶液,边滴边振荡,以免镉离子使蛋白变性产生沉淀,将溶液在25℃,100 r/min的摇床中作用24 h,然后用处理好的透析袋进行透析,除去未结合的镉离子,得完全抗原Cd-ITCBE-BSA,将于-20℃保存。同样方法制备Cd-ITCBE-OVA,合成路线见图1所示。

图1 镉离子人工抗原的合成

2.2 镉离子完全抗原的鉴定

2.2.1 镉离子完全抗原的SDS-PAGE鉴定 配制SDS-PAGE 5%浓缩胶和 10%分离胶,样品煮沸5 min,进行电泳,上样量为20μl（0.5mg/mL）,待指示剂距离分离胶底端1 cm时,关掉电源。考马斯亮兰染色液染色4 h,乙酸-乙醇脱色液脱色,用UVI-凝胶自动成像系统拍照。

2.2.2 镉离子完全抗原的紫外分光光度法鉴定以0.01M pH 9.0的硼酸盐缓冲液稀释等量（以蛋白量计算）的载体蛋白、ITCBE-载体蛋白、重金属-ITCBE-载体蛋白,在220-450 nm波长范围进行扫描（GBCCintra 303紫外分光光度计）。

2.3 小鼠的免疫

100μl Cd-ITCBE-BSA与等量的弗氏完全佐剂混合乳化。足垫注射免疫,50μl/只（0.5mg/mL（按蛋白量算））,免疫三只。一周后第二次免疫,免疫抗原与等量的弗氏不完全佐剂混合乳化,每只小鼠注射30μl（0.5mg/ml（按蛋白量算））的剂量。二免后5-7 d,小鼠断尾采血,检测效价。

2.4 检测小鼠的血清效价

用Cd-ITCBE-OVA包被酶标板,利用间接ELISA法检测小鼠血清效价,具体步骤参见文献[3]。读取OD490值,效价达到1∶3 200以上,进行细胞融合。

2.5 细胞融合

2.6 阳性杂交瘤细胞的筛选与克隆

融合后第10-12 d,待细胞增殖到96孔细胞板的1/15-1/10时,用间接ELISA方法检测细胞上清液,筛选出阳性细胞株。采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞克隆化,直到阳性率达到100%时为止。

2.7 单抗的制备

采用体内诱生法制备腹水。小鼠腹腔注入优级灭菌液体石蜡,350μl/只,5-7 d后,将杂交瘤细胞数调整为1-5×106个/m l,每只小鼠注射0.5 ml。经过10 d左右待小鼠腹腔鼓胀时,收集腹水,5 000 r/min离心20min,取上清,-20℃冻存。

2.8 腹水的纯化

利用亲和层析法纯化腹水。结合缓冲液稀释腹水,流经亲和层析柱时,目的蛋白会与亲和柱内的蛋白G结合,而杂蛋白随着结合缓冲液流出体系;再用洗脱缓冲液把目的蛋白洗脱,超滤浓缩,-20℃保存。然后对纯化的腹水进行SDS-PAGE鉴定,检测纯化腹水的效价。

3 结果

3.1 镉离子完全抗原的鉴定

3.1.1 镉离子完全抗原的SDS-PAGE鉴定 载体蛋白、ITCBE-载体蛋白、重金属-ITCBE-载体蛋白的分子量越来越大,而迁移速率逐渐变慢,初步证明完全抗原制备成功。鉴定结果见图2,3。

图3 镉免疫抗原的SDS-PAGE图

3.1.2 镉离子紫外分光光度法的鉴定 紫外分光光度法显示:载体蛋白BSA与OVA的最大吸收峰值分别为278 nm和279 nm;空载体ITCBE-BSA、ITCBEOVA的最大吸收峰值分别是268 nm和269 nm;免疫抗原Cd-ITCBE-BSA和检测抗原Cd-ITCBE-OVA的最大吸收峰值分别259 nm和275 nm。载体蛋白、螯合剂-载体蛋白以及重金属-螯合剂-载体蛋白三者不仅最大吸收峰值发生了漂移,而且三者的波形也发生了变化,从而进一步证明了完全抗原制备成功。结果如图4、5所示。

图4 镉免疫抗原紫外扫描图

图5 镉检测抗原紫外扫描图

3.2 小鼠血清效价的检测

小鼠足垫免疫12-14 d后,利用间接ELISA检测血清效价,达6 400,符合细胞融合的要求。

3.3 细胞融合、筛选与克隆化

选择血清效价最高的小鼠做细胞融合。融合率达到80.46%,如表1所示。融合后12 d左右,采用间接ELISA法筛选出11株阳性细胞,选择OD490值高的、针对Cd2+的、仅有一个细胞集落的细胞株进行克隆,经过3次克隆后阳性率达到100%,最终选此细胞株,命名为5E12,扩大培养,冻存。如表2所示。

表1 细胞融合与筛选结果

表2 杂交瘤细胞三次克隆结果

3.4 腹水的纯化

利用亲和层析柱纯化腹水,按照AKATA纯化系统设计程序进行纯化,结果显示流川峰值很高,绝大多数杂蛋白被排除;目的蛋白只有一个峰,说明洗脱很彻底。结果如图6所示。

图6 腹水纯化的亲和层析

3.5 腹水纯化的SDS-PAGE鉴定

纯化后的腹水进行SDS-PAGE电泳,可见清晰两条带,一条为重链,另一条为轻链,而且仅有两条带,得到了比较纯的单抗。结果如图7所示。

图7 腹水纯化SDS-PAGE图

3.6 腹水纯化后的效价

采用间接ELISA法检测纯化后的腹水,结果显示单克隆抗体5E12的腹水效价可达6.4×104,结果见图8。

图8 腹水型单抗5E12的检测

4 讨论

镉离子是小分子物质,不具有免疫原性,属于半抗原,不能刺激机体产生免疫应答,需要与大分子载体蛋白偶联才能达到免疫动物的要求。半抗原与载体连接时,应选择合适的方法,选择偶联方式应考虑半抗原的溶解度、稳定性、结合键的位置以及适合的偶联试剂等因素[4]。本研究选择双功能螯合剂ITCBE作为镉离子与载体蛋白BSA的偶联桥梁,完成了完全抗原的偶联。免疫的目的是使B细胞在抗原的刺激下分化、增殖,有利于细胞融合形成杂交瘤,尤其是增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的几率[5]。血清效价的高低与免疫次数及抗原剂量有很大的关系[6]。抗原剂量太小不能充分刺激机体的免疫系统,免疫应答弱,不会产生高效价的特异性抗体;抗原剂量太大可能会引起实验动物的免疫耐受,而且可能导致动物死亡[7-9]。免疫次数太少达不到免疫效果,不利于特异性抗体的产生;而免疫次数太多会对皮肤造成不同程度的损伤溃疡,造成微生物的感染从而与目的蛋白竞争免疫活性细胞,致使抗体量减少[10-12]。同时由于载体蛋白的免疫原性很强,抗原量太多,免疫次数太多,抗血清中针对载体蛋白的抗体占明显优势,针对小分子的抗体就会减少,不利于后期特异性单抗的筛选[13]。本研究采取足垫免疫,只免疫两次就足够刺激局部免疫系统,血清效价可达6 400以上。

影响细胞融合的因素主要有:第一,环境温度一般要控制在28-30℃,用PEG作用细胞时,细胞很脆弱,此时的环境温度不宜过低;第二,试验的所有试剂均要提前预热,尤其是PEG一定要在37℃中保温;第三,pH值的影响,基础培基RPM I1640的pH值要控制在7.0-7.4之间,太高太低均会影响融合率,PEG的pH值要控制在7.4-7.8之间;第四,PEG作用时间,PEG对细胞有毒害作用,作用时间太长导致细胞死亡,一般PEG作用时间为1min;第五,生物膜的流动性与温度成正比,在细胞可承受的温度范围内适当提高融合温度有利于提高融合率,因此水浴温度要保持在39℃;第六,离心时转速不宜过大、时间不宜过长,细胞经PEG作用后很脆弱,离心会对细胞造成机械损伤[14];第七,在每一步保质保量完成的同时,要尽量快,一方面降低了污染的几率,另一方面也有利于细胞保持活力,提高融合率。

5 总结

免疫检测方法所依赖的重金属-螯合剂-载体蛋白复合物单克隆抗体的制备技术已经成熟 。本研究成功获得了抗重金属镉离子的单克隆抗体,为研制相应的ELISA检测方法和其它免疫检测技术奠定了基础。有望为快速、灵敏、低成本、现场检测样品中的重金属提供一条可行的途径。

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