张治宇,苑福升,李力卓,胡 硕,孔大亮,高志学

（1.中国医科大学附属第四医院骨科,辽宁沈阳110031;2.中国医科大学附属盛京医院骨科;3.第二军医大学长海医院骨科;4.吉林大学中日联谊医院;5.中国医科大学北京顺义医院骨科）

应用分子生物学技术手段研发的新型抑癌基因、细胞因子、转染病毒等的抗肿瘤制剂已成为继手术、化疗、放疗之后最具有应用前景的肿瘤治疗方法[1,2]。鸡痘病毒基因组庞大,不仅可以有效的感染哺乳动物细胞,在哺乳动物细胞中表达早期基因,而且重要的是其不在感染的宿主细胞内表达具有感染性的病毒粒子[3-5],本文检测了以为鸡痘病毒载体构建的含HN基因的重组鸡痘病毒对肿瘤细胞SAOS-2的体外抑瘤效应。

1 材料与方法

1.1 材料及仪器

含HN基因的重组鸡痘病毒（rFPVHN）由解放军军事医学科学院11所构建并保存;SAOS-2肿瘤细胞由第二军医大学长海医院骨科实验室保存;Rhodamine123购自宝生物公司;MTT购自SIGMA公司;流式细胞仪BD FACSAria为DB公司产品;酶标仪Takara公司产品;1640培养基购自宝生物公司。

1.2 MTT染色法检测杀伤率

消化处于对数生长期的SAOS-2肿瘤细胞,计数（1×104个/孔）后培养于96孔细胞培养板,37℃,5%CO2条件下,培养至细胞贴壁生长。用无血清无双抗的 RPM I1640稀释FPV及vFV 3,以100MOI感染SAOS-2肿瘤细胞,2 h后补加完全的营养液（10%FBSRPMI1640）,分别于感染后 24、48、72 和 96 h,加入20μlMTT溶液（5mg/ml,溶于PBS中,经0.22μm滤器过滤除菌）,37℃,5%CO2继续培养4 h后,吸弃孔内培养上清液。每孔加入150μl DMSO,振荡10 min。应用酶标仪,于490 nm处检测各孔A值,并按以下公式计算杀伤率。

1.3 流式细胞仪分析检测细胞线粒体膜电位

消化处于对数生长期的HCT-8细胞接种于6孔细胞培养板中（2×105个/孔）,细胞贴壁后,以100 moi的 rFPVHN感染,37℃、5%CO2培养 2小时后补加完全的营养液。于感染后72 h后收集细胞,弃上清,PBS洗2次后重悬于300μl PBS中,加2μl 20 mg/m l Rhodamine123,避光室温放置0.5小时,PBS洗2次,流式细胞仪分析检测细胞线粒体膜电位。

1.4 含HN的重组鸡痘病毒转染肿瘤细胞后唾液酸含量的测定

收集转染72 h的OS732细胞,PBS洗2次,用100μl重蒸水重悬细胞,冰浴中用超声波细胞破碎仪制备细胞样品,按文献[6]的方法进行唾液酸含量的测定。在721紫外分光光度计,560 nm处测定唾液酸的A560值,取其平均值。

1.5 Caspase-3活性测定

250 g离心5min收集 2×106-5×106个细胞,用pH7.2的冷PBS洗1次,用200溶解缓冲液重悬。冰上孵育细胞30min。13 000 r/min离心5min,取上清做蛋白定量并进行Caspase-3活性测定。在水或DMSO中溶解底物DEVD-pNA或YVAD-pNA,配置成20mmol/L的储存液,-20℃避光保存。在100μg-500μg蛋白抽提物中底物浓度160-200μmmol/L,终体积50-100。将反应混合液置微量滴定板中,用微量滴定板分析仪在405 nm滤光片下读取反应数据。

1.6 统计学处理

统计学处理采用独立样本t检验。

2 结果

2.1 MTT法检测SAOS-2细胞死亡率

MTT法检测结果表明在感染量一定的条件下,随着作用时间的延长,rFPVHN致SAOS-2肿瘤细胞的死亡率也有所升高,在72 h达到峰值,继而下降（图1）。随着感染量的增高,在相同的作用时间内,rFPVHN致SAOS-2 SAOS-2细胞的死亡率均有所升高,但并不形成严格的剂量效应关系。以上结果表明重组病毒感染SAOS-2肿瘤细胞72 h后可最大限度地杀伤SAOS-2。

2.2 Rhodam ine123结合FACS检测线粒体功能

SAOS-2肿瘤细胞感染rFPVHN 72 h,SAOS-2线粒体吸附Rhodamine123的能力下降,流式细胞仪检测与正常SAOS-2肿瘤细胞及FPV感染的SAOS-2肿瘤细胞相比,被rFPVHN感染的SAOS-2肿瘤细胞峰向左移（图2）,说明rFPVHN的感染导致SAOS-2肿瘤细胞线粒体膜电位下降。

2.3 rFPVHN感染SAOS-2细胞后唾液酸含量的测定

从表1看,rFPVHN组血清唾液酸含量最低。这说明HN基因在体内发挥了神经氨酸酶的作用,显著降低了血清中唾液酸的含量。

图1 FPVHN致SAOS-2肿瘤细胞死亡率

图2 SAOS-2肿瘤细胞感染rFPVHN后线粒体吸附能力变化

表1 Sialic acid contents of infected SAOS-2 cells

2.4 Caspase-3活性测定

rFPVHN转染SAOS-2肿瘤细胞72 h后提取SAOS-2肿瘤细胞细胞浆蛋白质,利用特异性发色底物检测Caspase-3活性。从D值结果可以看出,rFPVHN转染SAOS-2肿瘤细胞72 h后激活了Caspase-3（图3）。

图3 rFPVHN转染SAOS-2肿瘤细胞后Caspase-3活性变化

3 讨论

骨肉瘤恶性度大,发病率高,转移较早,致残率高,好发于青少年和年轻成人,是恶性骨肿瘤中具有代表性的肿瘤,80%的骨肉瘤患者在确诊时已经在体内产生微小的转移灶。近年来随着新辅助化疗技术及随之开展的保肢技术在临床上的广泛应用,不仅仅使患者免受截肢之苦,患肢肢体功能明显改善,而且患者的5年生存率较20年以前有了显著的提

高[1-2]

。可是这并不能掩盖新辅助化疗及保肢治疗技术手术的局限性和其缺点,既新辅助化疗及手术治疗都是立足于直接杀伤肿瘤细胞,虽然杀灭了大多数肿瘤细胞,但是使正常组织受到同样的伤害,重要的是无法作到彻底消灭肿瘤细胞及微小的转移灶。

本研究中,测得rFPVHN可以导致SAOS-2细胞表面唾液酸明显减低。证明新城疫病毒HN基因表达产物HN蛋白的神经氨酸酶活性使其水解了SAOS-2肿瘤细胞表面的唾液酸,使SAOS-2肿瘤细胞表面抗原暴露于机体强大的免疫系统,增强了免疫系统对SAOS-2肿瘤细胞的识别和杀伤,这和相关研究表明新城疫病毒HN蛋白可以水解肿瘤细胞表面唾液酸,在一定程度上抑制了肿瘤细胞的免疫逃避[7]是一致的。

另外MTT法检测结果表明。在感染量一定的条件下,随着作用时间的延长,rFPVHN致SAOS-2肿瘤细胞的死亡率也有所升高,在72 h达到峰值,继而下降。流式细胞仪检测被rFPVHN感染的SAOS-2肿瘤细胞线粒体膜电位下降,72h后激活了Caspase-3。这说明在体外实验中,含HN基因的重组鸡痘病毒可以导致骨肉瘤细胞SAOS-2凋亡,其可能是通过线粒体途径诱导骨肉瘤细胞SAOS-2细胞凋亡,至于骨肉瘤细胞SAOS-2确切的凋亡机制还需要进一步更深层次研究。

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