刘大全,李东华,刘洪斌,宗春辉,高巧营

（天津市南开医院中西医结合急腹症研究所,天津 300100）

脓毒症（Sepsis）是创伤、烧伤、休克、感染、大手术后等临床急危重病患者的常见严重并发症之一,是感染引起的一种严重的全身炎症反应综合征（SIRS）[1-4]。另一方面,微生态学（microecology）是研究正常微生物群与宿主相互关系的生命科学分支,是微观层次的生态学,即细胞或分子水平的生态学。而肠道微生态学研究的主要内容是肠道正常微生物群与宿主和环境构成的相互作用、相互制约的微生态系客观规律。近几年的研究成果证明,离开肠道微生态学,对消化道生理、病理学的研究其结论必定是不完整的,也是不科学的不准确的[5]。当机体发生肠穿孔、腹膜炎进而引起脓毒症时,其胃肠道内的正常菌群必定发生相应的变化,致病菌本身或其代谢产物会参与全身的炎症反应,继而引起多器官功能障碍综合症（MODS）等严重后果。本研究运用荧光定量PCR和细菌培养的方法观察病理状态下动物模型肠道及腹水内的菌群变化情况,试图从微生态的角度进一步阐述脓毒症的发病机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar大鼠60只,雌雄各半,体重210-230 g,由中国药品生物制品检定所动物中心提供,动物合格证号SCXK（京）2005-0004。

1.2 主要试剂与仪器 粪便DNA提取试剂盒（QIAGEN美国）,普通PCR用Taq酶、荧光定量PCR试剂盒（均为北京天根生化科技有限公司）,细菌培养皿、细菌生化鉴定试剂盒（均为天津金章科技发展有限公司）,厌氧培养袋（梅里埃公司法国）;IQ5型荧光定量PCR仪（BIO-RAD美国）。

1.3 方法

1.3.1 实验分组 前期研究表明:盲肠结扎穿孔术后72 h动物模型的死亡率在50%-70%之间[6],故将Wistar大鼠60只,随机分为假手术组（20只）、模型组（40只）。

1.3.2 模型制作 参照Wichterman等[7]的盲肠结扎穿孔（CLP）方法,实验前12 h禁食、不限水,以10%水合氯醛按1 mL/kg剂量进行腹腔注射麻醉,无菌条件下开腹,分离盲肠,在距其末端2 cm处以1号丝线结扎,再用18号针头在盲肠末端穿孔2处,将盲肠放回腹腔后逐层关腹。假手术组于分离盲肠末端时,不进行结扎、穿孔。

1.3.3 标本取材与处理 造模72 h后,各组动物在无菌条件下开腹,取腹水进行细菌培养（如动物腹腔内无腹水,则注入2ml无菌生理盐水进行腹腔灌洗,然后取灌洗液进行细菌培养）,同时留取结肠内容物,使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

1.3.4 腹水细菌培养 取500μl腹水（或灌洗液）作为原液,用无菌生理盐水进行10倍的倍比稀释,将不同浓度的菌液分别接种于需氧培养皿（包括血琼脂培养皿、苯乙醇培养皿、麦康凯培养皿等）和厌氧培养皿上（厌氧培养皿放置于厌氧培养袋中）,分别在37℃培养箱内培养24 h和72 h。培养结束后选择适当的稀释度上生长的菌落进行镜检、耐氧试验和微量生化反应试验,以鉴定细菌的类型。

1.3.5 常规PCR反应 参照文献[8]并结合使用引物设计软件,针对双歧杆菌、乳杆菌、大肠埃希菌、脆弱类杆菌和粪肠球菌的16SrRNA序列设计特异性引物（见表1）。PCR反应体系为25μl,其中DNA模板2μl,上下游引物（浓度为 25 pmol/μl）各 1 μl,10×Buffer2.5μl,dNTP 2μl,Taq 酶0.5μl,水16 μl。反应程序为:94℃变性4min后,94℃30 s,50℃（或55℃）30 s,72℃30 s共32个循环,最后以72℃10 min延伸后结束。经试验摸索,大肠埃希菌、双歧杆菌和脆弱类杆菌PCR反应的理想退火温度为55℃,乳杆菌和粪肠球菌PCR反应的理想退火温度为50℃。其扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

表1 5种细菌的引物序列和扩增片段长度

1.3.6 荧光定量PCR反应体系为 20μl其中DNA模板0.5μl,上下游引物（浓度为5 pmol/μl）各1μl,2.5×RealMasterMix和20×SYBR Solution的混合液9 μl,水8.5μl。反应程序为:94℃变性4 min后,94℃30 s,50℃（或 55℃）30 s,72℃30 s共40个循环,最后以68℃10min延伸后结束。

1.3.7 标准曲线的制作 参照文献[8]的方法,取准确定量的细菌菌株作为标准品（为天津市南开医院细菌室保存的质控菌株）做系列稀释后,使其细菌浓度为105109拷贝/m L,并使用DNA提取试剂盒提取基因组DNA。以该DNA为模板进行荧光定量PCR。标准曲线以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标,以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）为纵坐标绘制而成。待测样品的PCR结果和标准曲线进行比较,即可获得各待测样品中5种细菌的具体数量。

2 结果

2.1 腹水细菌培养 模型组大鼠40只,造模72 h后仍存活的有23只,大多数个体有较多的腹腔渗出液,其性状为淡黄色或淡粉色混浊半透明液体。假手术组全部存活,大多数个体无明显的腹腔渗出液,收集腹腔灌洗液进行检测。两组动物腹水或腹腔灌洗液细菌培养结果见表2。另外,初次厌氧培养出的菌落经耐氧试验筛选后证明全部是需氧菌和兼性厌氧菌,即两组动物的腹水中没有专性厌氧菌被检出。

2.2 PCR产物电泳鉴定 PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳显示5种细菌的16SrRNA扩增片段,见图1。

表2 两组动物腹水中细菌检出率比较（百分率%）

图1 细菌16SrRNA扩增片段电泳结果

2.3 荧光定量PCR标准曲线生成 以标准菌不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标,以PCR反应过程中出现荧光信号的初始循环数（Ct）为纵坐标绘制生成该菌的标准曲线,图2为大肠埃希菌的标准曲线。

2.4 肠道菌群定量 通过荧光定量PCR反应,将待测样品的检测结果和标准曲线进行比较,获得各样品中5种细菌的具体数量。与假手术组相比,模型组肠道中双歧杆菌和乳杆菌的数量明显减少（P＜0.01）,而大肠埃希菌的数量则有所增加（P＜0.01）,脆弱类杆菌和粪肠球菌的数量无明显变化（P＞0.05）。图3为大肠埃希菌荧光定量PCR反应曲线;两组动物肠道菌群比较见表3。

图2 大肠埃希菌的标准曲线

图3 大肠埃希菌的荧光定量PCR反应曲线

3 讨论

人类胃肠道表面所携带正常菌群的重量差不多有1千克,相当于最大消化腺-肝脏的重量,它们既参与机体代谢的全过程,又参与许多肠道毒物的分解、消化过程,与宿主健康状态休戚相关。人的一生一般要经历两次正常微生物群的演替过程,第一次是从出生到第1-2周左右,肠道从无菌到有菌,形成具有婴幼儿特点的肠道菌群;第二次演替是从乳喂养到混合喂养,肠道菌群会发生大的变动。成人肠道菌群是相对稳定的,一般因为患病或是用药才会发生变动[9]。人类胃肠道约有300 m2的粘膜表面,种植着上万种不同种群约1013-1014个细菌。在胃肠道不同部位,细菌的定植情况也不相同。胃内的正常寄生微生物包括链球菌、葡萄球菌、乳杆菌等,由于胃酸的抗微生物作用使得正常的胃内的大部分细菌被杀死,除了幽门螺旋杆菌外,其他的胃细菌仅仅在胃酸减少的患者中明显可见。从小肠分离出的微生物种群有乳杆菌、链球菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、类杆菌、韦荣氏球菌、葡萄球菌、放线菌属、酵母菌、白色念珠菌、嗜血菌等。耐酸厌氧型革兰阳性菌种控制着小肠上端部位,而越靠近远端,革兰阴性菌逐渐增加而占统治地位。大肠中隐匿有超过500种细菌种群,其中90%以上是专性厌氧菌,主要包括乳杆菌、链球菌、双歧杆菌、梭状芽孢杆菌、丙酸杆菌、优杆菌、类杆菌、梭杆菌属、韦荣氏球菌、葡萄球菌、酵母菌、放线菌、肠杆菌、肠球菌、粪球菌、消化链球菌属等[10]。

本研究发现,模型组动物进行盲肠结扎穿孔后,其机体依次发生了不完全性肠梗阻、肠穿孔和腹膜炎等病理改变,其肠道内的正常菌群也发生了相应的变化,在正常状态下占优势地位的双歧杆菌、乳杆菌等益生菌数量明显减少,而大肠埃希菌的数量则有所增加。其中双歧杆菌和乳杆菌均属于肠道益生菌,它们参与构成肠道的正常防御系统。益生菌在肠道中发挥重要的生理作用,益生菌通过占据肠黏膜表面,提高上皮细胞的防御能力,还可以产生有机酸、游离脂肪酸、氨和过氧化氢,具有降低酸度并抑制或拮抗致病菌的作用。如双歧杆菌及其表面分子能提高NK细胞和巨噬细胞活性,其代谢产物如小分子酸过氧化氢等活性物质形成化学屏障,阻止致病菌侵入和繁殖,进而提高局部或全身的抗感染能力。目前益生菌在治疗医学领域的应用面不断扩大,可以应用益生菌进行治疗的疾病包括:抗生素相关性腹泻（AAD）、肠易激综合症（IBS）、炎症性肠病（IBD）、幽门螺杆菌感染、各种便秘、结肠癌和高胆固醇血症等[11]。

另一方面,在本研究中动物腹水细菌培养结果显示:模型组大肠埃希菌的检出率达到100%,说明大肠埃希菌是该模型大鼠主要的致病菌或致死菌。而链球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、摩根氏菌和微球菌等检出率也高于假手术组,上述细菌多数属于条件致病菌,在正常的肠道中也是存在的,但数量有限并且与益生菌之间保持平衡状态,当机体发生肠梗阻、肠穿孔、腹膜炎和脓毒症时这种平衡被打破,条件致病菌则会在肠道、腹腔甚至在血液中大量繁殖,进而引起MODS甚至死亡等严重后果。

综上所述,本研究在脓毒症大鼠模型研究的基础上,进一步对其肠道微生态结构进行分析,发现了脓毒症大鼠与正常大鼠肠道菌群的结构变化,找出了导致脓毒症大鼠患病甚至引起死亡的主要致病菌群。从一个新的角度解释了脓毒症的病理过程,也同时为达成有效降低脓毒症死亡率这一全球的共同目标提供理论依据。

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