周 彤,于慧美,苏 静,郑向雨,徐 冶,2,孙连坤*

（1.吉林大学a.08级临床医学五年制;b.白求恩医学院病理生理学系,吉林长春 130021;2.吉林医药学院组织学与胚胎学教研室）

卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤之一,死亡率却居妇科恶性肿瘤首位[1]。术后常规治疗方案是在细胞减灭术的基础上进行以顺铂为主的联合化疗。顺铂是广泛使用的化疗药物,但由于原发或继发的多药耐药的存在,严重影响了化疗的疗效及患者预后[2,3]。已有研究表明,细胞顺铂耐药的形成与内质网应激有关[4,5]。顺铂能诱导细胞内形成大量泛素化的未折叠及错误折叠蛋白,而细胞内绝大部分聚集蛋白和大部分可溶性蛋白通过自噬途径清除[6,7]。如果细胞内堆积的错误折叠蛋白不能及时清除,就会引发细胞发生内质网应激介导的凋亡。本实验通过比较顺铂诱导人卵巢癌细胞SKOV3和SKOV3/DDP内质网应激的差异,进而探讨SKOV3/DDP细胞顺铂耐药的机制,希望为人卵巢癌的临床治疗提供新的理论基础和实践依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人卵巢癌细胞株SKOV3和SKOV3/DDP购买自中国科学院和北京协和医院;RT-PCR试剂盒、限制性内切酶 、DL2000（TaKaRa）;胎牛血清 、Trizol 、RMPI-1640培养基（Invitrogen）;T4 DNA连接酶、反转录试剂盒（Promega）;质粒小抽试剂盒（Takara）;细胞裂解液（碧云天）;IRE-1α抗体（santa cruz）;PERK抗体（santa cruz）;β-actin 抗体（santa cruz）;XBP-1引物合成（上海生工生物技术有限公司）,其它试剂为进口或国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SKOV3和SKOV3/DDP细胞均采用含10%胎牛血清的RMPI 1640培养液培养,两种细胞均采用0.4%胰酶消化传代培养。顺铂耐受型细胞株SKOV3/DDP在培养过程中需要加入1μg/ml顺铂,以维持SKOV3/DDP细胞表型及耐药性。

1.2.2 MTT 细胞按1×104个/孔接种于96孔板,待细胞达到对数生长期,按梯度加入不同浓度的顺铂。培养24 h后,每孔加入20μlMTT,孵育4-6 h后,弃掉培养液,每孔加入150μl的DMSO,充分溶解甲瓒。酶标仪上选取570 nm波长,测定各孔的吸光度值,记录结果。

1.2.3 XBP-1引物设计及RT-PCR扩增检测 根据NCBI提供的XBP-1的序列,利用DNAman设计人源的XBP-1引物。XBP-1引物序列为 5′-GAATGAGTGAGCTGGAAC-3′,5′-GGTCCAAGTTGTCCAGAAT-3′。GAPDH引物序列为5′-GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT-3′,5′-AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGT-3′。

顺铂作用两种细胞不同时间点,用Trizol裂解并提取总RNA,各取5μg RNA经逆转录反应成cDNA备用。RT-PCR扩增XBP-1片段。RT-PCR的反应体系为 :sense primer 、antisense primer各为 0.5 μl、2×TaqMaster 10 μl、cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl,总体积为20μ1;反应条件如下:94℃,60 s,55℃,30 s;72℃,60 s,共进行30个循环。

1.2.4 Western Blot 顺铂作用两种细胞不同时间点后,细胞裂解并提取蛋白,测浓度后取60μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,采用BIO-RAD转移装置将蛋白转移至PVDF膜,用5%的脱脂奶粉封闭膜上的非特异结合位点后,分别加入1∶200稀释的 IRE-1α、PERK、β-actin等抗体孵育过夜后,再分别加入 1∶1 000稀释的二抗孵育。DAB显色,凝胶成像系统采集图像后保存。

2 结果

2.1 MTT法检测顺铂对人卵巢癌细胞生存率的影响 不同浓度的顺铂分别作用SKOV 3和SKOV3/DDP细胞24 h,检测顺铂对人卵巢癌细胞生存率的影响。结果显示,两种细胞对细胞均表现出时间依赖性和剂量依赖性。顺铂作用24 h,SKOV3细胞的IC50为8.25μg/m l,SKOV3/DDP的IC50为26.13 μg/m l（P＞0.05,n=3）（见图1）。

2.2 Western b lot检测内质网应激相关蛋白表达顺铂（6μg/ml）分别作用SKOV3和SKOV3/DDP细胞0 h、12 h、24 h,收集细胞,提取细胞总蛋白。Western blot分析两种细胞在顺铂作用不同时间点IRE-1α、PERK蛋白的表达情况。结果显示,顺铂明显激活SKOV3细胞中的内质网应激相关蛋白表达（P＜0.01,n=3）,而对SKOV3/DDP细胞中相关蛋白表达没有明显影响（P＞0.05,n=3）（见图2）。

图1 顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞生存率的影响（*P＜0.05,n=3）

图2 顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞内质网应激相关蛋白表达的影响（**P＜0.01,n=3）

2.3 RT-PCR检测XBP-1mRNA表达 顺铂分别作用SKOV3和 SKOV3/DDP 细胞0 h、12 h、24 h,收集细胞,提取细胞总RNA。RT-PCR分析,结果显示顺铂诱导SKOV3和SKOV3/DDP细胞中XBP-1基因表达,但是SKOV3/DDP细胞中XBP-1基因上调更明显（P＜0.01,n=3）（见图3）。

3 讨论

据统计全球每年有4%的女性恶性肿瘤患者死于卵巢癌[8],目前术后常规治疗方案是在细胞减灭术的基础上联合应用顺铂为主的化疗的综合治疗。顺铂是广泛使用的一线化疗药物,以顺铂为主的联合化疗已在卵巢癌、头颈部肿瘤和肺癌中卓见成效。

图3 顺铂对SKOV3和SKOV3/DDP细胞XBP-1基因表达的影响（**P＜0.01,n=3）

虽然目前顺铂耐药的机制还不是很清楚,但是已明确这涉及到多方面因素,包括:①细胞通过阻碍顺铂与DNA结合;②增强解毒性;③提高DNA的修复;④调节转运蛋白的表达;⑤激活促细胞存活的一系列基因的表达,如 Bcl-2,Erk-1/2和 NF-kB等[9,10]。最近的研究表明顺铂能够诱导细胞内形成错误折叠蛋白积累,从而诱发内质网应激,最终导致细胞凋亡的发生。许多生理和病理情况,如缺氧、内质网Ca2+耗竭、氧化损伤、高脂饮食、低血糖、病毒感染等均可能导致内质网蛋白折叠负荷能力的失衡,导致未折叠蛋白在内质网内的堆积,即发生内质网应激[11]。当细胞处于内质网应激状态时,可以激活细胞内的信号传导系统和相关的降解途径,清除细胞内积累的错误折叠的蛋白,减弱细胞应激水平,但是当内质网损伤的程度持续加重不能被恢复时,内质网应激可以导致细胞死亡。

我们的研究发现,SKOV3和SKOV3/DDP细胞对顺铂的敏感性存在显著差异。顺铂（6μg/ml）可以诱导SKOV3细胞发生内质网应激,并导致内质网应激介导的细胞凋亡的发生,而同等浓度的顺铂对SKOV3/DDP细胞内质网应激相关蛋白没有明显的影响。XBP-1是一种特殊的基因,一般在内质网应激的时候被激活,激活形式的XBP-1能够抑制细胞内新蛋白的合成,缓解内质网加工修饰蛋白的压力。在我们的结果中,顺铂明显激活SKOV3细胞中内质网应激蛋白表达;与SKOV3细胞相比,SKOV3/DDP细胞中内质网应激相关蛋白水平很低,顺铂对内质网应激相关蛋白诱导表达不明显,但能显著提高XBP-1基因表达。由此本研究提出内质网应激信号通路在肿瘤化疗耐药机制中可能具有重要作用,可能为临床肿瘤治疗研究提供新的思路。

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