李萌萌 刘晓丹 曹梦瑶 张肖雅 刘华晶

东北农业大学资源与环境学院 黑龙江省 哈尔滨市 150030

DNA分子标记在食用菌研究中的应用

李萌萌 刘晓丹 曹梦瑶 张肖雅 刘华晶

东北农业大学资源与环境学院 黑龙江省 哈尔滨市 150030

随着分子生物学的发展，越来越多的DNA分子标记技术不断涌现并应用于在食用菌遗传育种、菌种和菌株鉴定、遗传多样性分析、基因定位和克隆等研究中。本文对DNA分子标记RAPD、SCAR、ISSR等方法的原理、特点和其在食用菌遗传多样性鉴定方面的研究进展进行了重点阐述。

分子标记技术是20世纪80年代发展起来的一类遗传标记技术。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传变异的直接反映。至今已经发展了20多种基于DNA多态性的分子标记技术。这些DNA标记技术可综合为4大类：一是以Southern杂交为基础的标记技术，如RFLP；二是以PCR为基础的标记技术，如RAPD、ISSR等；三是酶切和PCR相结合的标记技术，如AFLP、CAPS等；四是其他DNA分子标记，如SNP。与其他几种遗传标记相比，分子标记具有很多优越性，如大多数分子标记是共显性遗传，对隐性的农艺性状的选择十分便利；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记直接揭示来自DNA的变异。

1 RAPD(随机扩增多态性)标记技术

RAPD技术是1990年由Williams和Welsh领导的两个研究小组几乎同时独立发展起来的。它是建立在PCR基础之上,使用一系列具有10个碱基的单链随机引物，对整个基因组DNA进行PCR扩增以检测多态性。由于不同引物扩增出的DNA片段不同，因此存在着大量的RAPD标记。由于整个基因组内存在众多反向重复序列，因此需对每一随机引物单独进行PCR，单一引物结合在反向重复序列上，在其之间的区域内,若遗传特性发生变化,经PCR扩增后， 则导致一系列PCR产物表现差异性，由于使用一系列引物，几乎整个基因组差异都会显露出来，经聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离后，通过EB染色或放射自显影就可检测出被扩增的DNA多态性。

目前对多种食用菌的生活史和遗传背景还不十分清楚，这给食用菌遗传研究工作带来很大困难。以往菌株的亲缘关系和食用菌遗传资源受环境因素影响，往往难以对形态差异较小的种间和种内菌株加以鉴别，给杂交亲本的选择带来很大困难。利用RAPD分子标记技术选择亲本可克服传统方法的缺点，利用分子标记所揭示的多态性通过各种数量分析方法计算相似系数，进行聚类和排序分析，确立供试菌株的亲缘关系或进行种内遗传多样性研究[1]。种质鉴定和杂交种的鉴别是育种研究工作中的一个关键问题。运用RAPD技术对融合子和亲本进行聚类分析和相似系数分析,可以判断原生质体融合是否成功,染色体是否发生交换。

2 ISSR (简单重复序列间扩增)标记技术

ISSR是一种新型的分子标记，是1994年由zietkiewicz等创建的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。ISSR标记利用植物基因组中广泛存在的简单重复序列设计引物，引物由1～4bp组成的串联重复序列和几个非重复序列的锚定碱基组成，使引物与基因组DNA中SSR的5’或3’末端结合，对反向排列、间隔不太大的重复序列间基因组进行PCR扩增。ISSR标记具有如下特点:(1)直接利用SSR对基因组DNA进行PCR扩增,适用于任何物种。(2)符合孟德尔遗传规律,多为显性标记。(3)稳定性和可重复性高。(4)引物具有通用性。ISSR标记结合了RAPD和SSR方法的优点，具有模板用量少、多态性丰富、无需试剂盒等优点,但多为显性标记,不适于研究交配系统、计算杂合度和父系分析等问题。ISSR标记可广泛应用于动植物种质鉴定、遗传作图和基因定位,尤其在分子遗传学基础贫乏的作物研究中显示出极大的优势。梁宇采用ISSR标记对外生菌根菌隐花青鹅膏菌的居群遗传结构进行了研究,分析结果表明,遗传变异主要表现在同年生子实体内,隔年生子实体的变异情况也较明显。此外，在其他如菊科作物中ISSR技术也被应用在种质资源鉴定[2]。

3 SCAR (特征性片段扩增区域)标记技术

1993年,PARAN I和MICHELMORE RW在RAPD标记基础上提出了SCAR标记。该标记以特异RAPD片段序列为基础,根据两端序列设计1对18～24个碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异性扩增，实现由RAPD标记到SCAR标记的转化。它直接采用专一性特异引物进行PCR扩增,排除了随机引物结合位点之间的竞争，且避免了筛选引物、估算样品间遗传相似性和聚类分析等繁琐过程,使稳定性和重复性得以显著提高。SCAR标记一般表现为扩增片断的有无,适合于大量个体的快速检测,便捷可靠；目前SCAR标记已被广泛应用于许多重要农林经济作物的种质鉴定、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱构建和基因定位等方面研究。SCAR标记需要根据目的片段的两端序列设计引物,无法进行直接分析,一般是对RAPD或AFLP标记进行克隆、测序后转换为SCAR标记。由于RAPD扩增过程中碱基并非严格匹配,错配率较高，且一般RAPD标记片段同源性较高,从而导致SCAR标记的转换成功率较低。在食用菌研究中,如果能获得各个菌株的特异SCAR标记,不仅能对种质资源的遗传多样性进行系统地分析评估,可以从分子水平上进行伪劣菌种辨别。熊芳等为有效解决鲍鱼菇市场菌种名称异常混乱的现象,对全国16株常用鲍鱼菇栽培菌株进行SRAP-PCR、RAPD-PCR扩增,从电泳图谱上选取特异片段,成功转化成SCAR标记,通过构建的4对SCAR特异性引物,将这16株鲍鱼菇菌株分为5类,有效地解决了鲍鱼菇市场上常见的同种异名、同名异种现象[3]。

4 结语

对于食用菌种质群鉴定和多样性评价,RAPD是一个简单、经济、快捷的技术工具。RAPD分析便于绘制简单的数量性状图谱,已经被用于分析这些基因,鉴定与性状相连锁的分子标记； ISSR标记与RAPD等标记技术相比，具有更强的专一性、重复性和可操作性；SCAR标记技术因其具有稳定性高、重复性好，成本低廉，操作简单方便等特点，已经广泛应用于各种农作物的品种鉴定、辅助选择育种、基因定位等方面，在食用菌菌株鉴定中也开始受到重视。

总之，随着分子标记技术的深入，更多的食用菌功能基因将被标记，更高密度、更为实用有效的遗传连锁图谱将被建立，大量重要的基因将被定位、分离和克隆，这将为进一步培育高产、优质、抗病、耐贮等新品种奠定良好的基础。

[1]吕长武,吕杰,陈恒雷 等. RAPD分子标记在食用菌研究中的应用[J].中国生物工程杂志.2006, 26(1): 77~80

[2]曾丽,赵梁军,孙佳 等.万寿菊属品种资源遗传关系的ISSR分析[J]. 中国农业科学.2010,43(1):215-222

[3]熊芳, 郑闽江, 刘新锐 等. 鲍鱼菇种质资源SCAR标记的建立及其初步应用[J]. 中国农学通报.2010,26

(11):330-335

东北农业大学大学生科技创新基金，东北农业大学资源与环境学院青年基金

10.3969/j.issn.1001-8972.2011.02.029

李萌萌（19890206），女，东北农业大学资源与环境学院应用生物科学专业08级本科生；

刘华晶（19790212），女，东北农业大学资源与环境学院讲师。

ISSR；SCAR；RAPD；食用菌