姜美娟，王华强，王丹丹，梁冰

凝固酶阴性葡萄球菌生物膜形成与检测的研究进展

姜美娟，王华强，王丹丹，梁冰

凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase-negative staphylococci，CoNS）是人体皮肤和黏膜上定居的正常菌群之一，因其几乎不产生对人体有毒性的酶和毒素，故一般认为是非致病菌。20 世纪 70年代以前，关于 CoNS 引起的感染仅有个别报道，20 世纪 80年代后，由于革兰阳性菌的抗生素广泛使用，以及介入性治疗、留置导管和组织器官移植等治疗手段的应用，CoNS 成为医院感染的重要机会致病菌之一，并出现多重耐药株。本文就 CoNS 生物膜的形成与检测进展进行了综述。

1 CoNS 生物膜的形成及调控

在 CoNS 引起的常见感染中，生物膜的形成是最为重要的致病因素。细菌生物膜是指细菌附着在有生命或无生命物质表面，被自身分泌的胞外黏质物包裹的、具有高度组织化的多细胞群体结构。1972年，Bayston 和 Penny[1]首先认识到表皮葡萄球菌生物膜形成与其在多聚物表面定植有关。后来，通过扫描电镜发现表皮葡萄球菌在导管表面定植，多层细菌嵌于多糖－蛋白复合物中形成生物膜。

1.1 生物膜组成成分

生物膜中水分含量可高达 97%，除了水和细菌外，生物膜还可含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质、代谢产物及细菌裂解产物等。因此，生物膜中的生物大分子主要包括蛋白质、多糖、DNA、RNA、肽聚糖、脂类和磷脂等物质，其结构较为复杂，是细菌抵抗外界不利因素的产物。

1.2 生物膜形成过程

细菌生物膜的形成是一个动态的过程，有多种因子参与，主要分为两个时相：首先是黏附，早期 CoNS 黏附于生物材料表面主要借助于两者之间存在的理化作用力，后期黏附则通过细胞外基质成分和血液蛋白组分来完成，需要受体与配体的相互识别与结合，因而具有选择性和特异性。第二步是聚集，单层细菌黏附于生物材料表面后，在胞间多糖黏附素（polysaccharide intercellular adhesion，PIA）等因子的介导下，细菌之间相互聚集，继而分化、增殖，形成多层的细胞团块，同时分泌大量的黏液样物质将之包裹其中形成生物膜[2]。

1.3 生物膜形成相关因子及其基因调控

生物膜形成的黏附阶段需要很多因子参与，如膜多糖黏附素、自溶酶、纤维蛋白原结合蛋白和葡萄球菌表面蛋白等[3-4]。其中，介导 CoNS 初始黏附功能较为肯定的有 atlE和 Fbe 基因。文献[5]报道，表皮葡萄球菌菌株中广泛存在atlE、Fbe 基因，阳性率可达 85% ～ 95%。因此，可以认为大多数表皮葡萄球菌都具有初始附着功能。

在完成初始附着后能否进一步相互聚集形成细菌生物膜，需要聚集相关因子的参与。在细菌生物膜形成的聚集阶段，需要胞间多糖黏附素血凝素和聚集相关蛋白等因子参与。其中，PIA 是细菌生物膜形成聚集阶段所必需的物质[6-9]。Mack 等[10]发现缺乏 PIA 的表皮葡萄球菌初期黏附到生物材料上的能力正常，而后期细胞间相互黏附能力却大大下降，无法形成生物膜。提示 PIA 在介导细胞间相互黏附中是不可缺少的。

Heilmann 等[11]通过微量板半定量法发现表皮葡萄球菌ica 操纵子编码的乙酰葡糖胺转移酶对合成 PIA 以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。ica 基因缺失的 SE 不易形成成熟的细菌生物膜，而细菌生物膜形成阳性的 SE 大多存在 ica 基因。因此，ica 基因是合成 PIA 的分子基础。

ica 最初是应用转座子突变技术在表皮葡萄球菌生物膜形成缺陷菌株中分离得到的。ica 基因座定位于细菌染色体，全长 3.4 kb，包括 icaR 调节基因及串联存在的 icaA、icaD、icaB 和 icaC 结构基因。其中，icaADBC 4 个基因构成一个操纵子，可以通过检测 icaADBC 基因来反映 ica操纵子的存在。icaA 单独呈现低的 N-乙酰葡糖胺转移酶活性，生物膜的形成要求 icaD 编码的产物具有最佳活性；icaA 和 icaD 共表达时，可使酶活性大大提高，可合成最大链长达 20 个残基的寡聚物。icaC 编码一种未被确定的膜蛋白质，可以合成一条更长的寡聚链[12]，icaC 很可能涉及到把不断合成的多糖物质转运至细胞的表面，而 icaB 负责脱去多聚-N-乙酰葡聚糖胺分子的乙酰基，在 icaB 等位基因突变株中，未脱乙酰基的多聚-N-乙酰葡聚糖胺分子不能附着到细菌细胞表面介导生物膜的形成[13]。icaR 蛋白不参与自身转录调节，但 icaR 基因插入突变 icaADBC转录增加 5.8 倍以上，互补实验也证明 icaR 基因编码icaADBC 阻遏蛋白，调节 icaADBC 转录[14-15]。

葡萄球菌生物膜的形成与环境因子密切相关。在不同环境因子作用下，通过不同通路影响 ica 操纵子的表达，调节生物膜的形成。Knobloch 等[16]研究表明，环境渗透压能诱导 icaADBC 的表达，从而影响细菌生物膜的形成；ica基因编码参与 PIA 合成的糖基转移酶，葡萄糖可以通过直接或间接诱导糖链合成相关基因 ica、AtlE 等的表达而影响生物膜的形成。

2 CoNS 生物膜的检测方法

由于凝固酶阴性葡萄球菌正常定植于皮肤、黏膜等组织表面，常常在分离培养过程中引起污染，对 CoNS 感染的正确诊断产生干扰。因此，临床实验室亟需解决 CoNS 污染菌和致病菌的界定问题。在 CoNS 形成生物膜过程中，PIA 的作用通过动物模型和临床研究已得到确认。Christensen等[17]报道，60% 有临床意义的血培养分离 CoNS 产生了PIA。虽不能直接说明 PIA 产生和疾病发生的关系，但差异有统计学意义。黄长武等[18]也证实，PIA 阳性菌株均能形成生物膜。从一些临床分离凝固酶阴性葡萄球菌产生 PIA的研究中发现，胞间多糖黏附素有助于细菌黏附到手术插管、血管壁和瓣膜等表面，使抗生素难以清除并成为新的感染源。胞间多糖黏附素被认为是 CoNS 具有临床意义的标志，也是 CoNS 重要的毒力因子[19]。CoNS 胞间多糖黏附素检测可提示其致病意义及其耐药性变化，对明确感染诊断、制订有效治疗方案有十分重要的意义。

2.1 刚果红实验（CRA）

检测 CoNS 胞间多糖黏附素比较经典的表型鉴定方法为刚果红实验，即直接向培养基加入刚果红，使菌落在形成过程中显色，根据菌落的颜色来反映 CoNS 表达 PIA 的情况，进而可以间接地反映出其致病性。梁冰等[20]对临床分离的 114 株 CoNS 进行了 CRA 实验，结果实验阳性率仅为 21.1%（24/114），与 PCR 扩增结果及黏附性实验结果均存在统计学差异，差异多见于溶血葡萄球菌、人葡萄球菌、头状葡萄球菌等，原因在于胞外多糖作为 CoNS 的次生代谢产物，其分泌量及分泌的稳定性在不同的菌种间会存在差异。另外，刚果红实验的方法学本身易于受多种因素影响，比如：蔗糖的浓度、氯化钠和琼脂的浓度、气体条件等，干扰了实验结果的正确性，不能满足临床要求。

2.2 半定量黏附性实验

即采用微量板半定量法模拟体内环境进行 CoNS 体外黏附性实验[21-22]。梁冰等[20]采用酶联免疫分析仪对 24 株CoNS（包括 CRA 阳性 ica D 阴性 3 株、CRA 阴性 ica D 阳性 14 株及两法均阳性 7 株）经 96 孔细胞培养板体外黏附后进行浊度测定，结果刚果红实验阳性率 41.7%（10/24），黏附实验阳性率为 83.3%（20/24），经卡方分析，χ2= 5.785，P＜ 0.05，两实验结果差异具有统计学意义；ica D 片段的 PCR 扩增阳性率为 87.5%（21/24）与黏附实验阳性率比较 χ2= 0.143，P＞ 0.05，两实验结果间的差异无统计学意义。该方法用光吸收原理检测生物膜成分，但生物膜本身的结构会受到破坏。且由于方法比较复杂，需要严格控制实验条件才能获得较好的重复性。因此，不适于临床微生物实验室对 CoNS 黏附能力的常规检测。

2.3 PCR 技术

近年来的研究认为区别致病性葡萄球菌与皮肤正常菌群的重要标志物是 ica 基因，因其对合成 PIA 以及在细菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。采用 PCR 技术对 ica 操纵子结构基因片段进行扩增，对于指导临床常见CoNS 感染的诊断和制订有效治疗方案具有十分重要的意义。梁冰等[23]采用 PCR 方法对 ica 操纵子串联基因 icaD片段进行基因扩增，并将其结果与临床相关性进行了研究，结果 icaD 片段扩增总阳性率是 29.0%（33/114）；江娟等[24]对 101 株表皮葡萄球菌临床分离株进行了生物膜形成能力检测，发现只有 32 株能够形成生物膜，两报道结果基本相符。表明大部分 CoNS 不表达胞外多糖，无致病性，或者临床分离的绝大部分 CoNS 可能是低毒性，源于正常菌群的污染。

综上所述，目前的研究多局限于实验室突变菌株，不能完全反映 CoNS 临床株的自然状况，且多基于细菌的浮游生长方式、单一时点的研究，不符合细菌附着生长的特性。而生物材料表面细菌生物膜的形成及其特性与浮游状态下的细菌团块明显不同。

2.4 扫描电镜技术

近年来，激光共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）和环境扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）的应用在生物医学研究中备受关注。有学者利用 CLSM 观察涤纶材料表面细菌生物膜结构，测定其厚度[25-26]。CLSM 可以直接对完整自然水化、生活状态的生物膜进行动态观察，并能对细菌生物膜进行连续断层扫描，获得不同层面的精细图像，同时可以测量生物膜的厚度。荧光染色后对材料表面生物膜及细菌群落进行定位观察。环境 SEM 可对生活状态的细菌进行扫描，避免了传统透射电镜对标本的脱水、固定、包埋及染色等处理对生物膜结构的破坏和组成成分之间的影响，且具有强大的放大作用及极高灵敏度，可用于观察细菌生物膜表面超微结构。但在研究生物膜的化学组成、物理性能以及生物学活性等方面，这些方法都有较多缺点。而且 CLSM 和 SEM 均需昂贵的仪器设备，操作繁琐，不易推广应用。

综上所述，应当通过多种方法来分析 CoNS 的临床意义，但就实验室现有条件，ica 基因的 PCR 检测和半定量黏附检测法更适合作为临床分离葡萄球菌株致病力判定的实用方法。

3 CoNS 生物膜检测的临床价值

随着生物高分子材料在医学领域中的广泛应用，具有产生生物膜能力的 CoNS 在院内感染的重要性已得到充分认识[27]。有报道[28]称人工瓣膜术后心内膜炎中，约有 40% ～50% 由表皮葡萄球菌引起；导管污染可使腹膜透析患者发生腹膜炎，CoNS 检出比例占此类感染病原菌的 40%。生物被膜一旦形成，不仅有利于细菌抵抗宿主的免疫防御反应，而且可通过各种机制诱导细菌产生耐药性，从而导致CoNS 感染呈现慢性、持续性和反复性的特点，成为感染难以控制的根源。

CoNS 生物膜的形成有赖于编码 PIA 合成酶的 ica基因表达，在上述报道的诸多体外检测方法中，有些学者认为 ica 基因可作为判断临床标本中分离的葡萄球菌是污染菌还是有意义菌的重要标志[29]。自 2006年以来，梁冰等[23]通过 ica 基因片段扩增方法，分别对从痰液、血液、静脉置管、尿液、伤口分泌物、胸腹水、前列腺液、脑脊液等临床标本中分离的 114 株 CoNS 进行了生物膜的检测，结果ica 操纵子携带率以深静脉置管（44.4%）、伤口分泌物（42.1%）和血液（36.8 %）较高，而呼吸道标本占 24.0%，尿液占 14.1%；ica 操纵子阳性菌株比率以表皮葡萄球菌最高（42.6%），其次为溶血葡萄球菌的 19.0% 及人葡萄球菌的 16.7%。因此 ica 操纵子可出现在多种 CoNS 中，以表皮葡萄球菌为主；CoNS 存在于不同部位具有不同意义，血液中分离的 CoNS 被污染的可能性大，而呼吸道和尿标本中检出的 CoNS 应慎重评价。114 株临床分离的 CoNS中，icaD 片段扩增总阳性率为 29.3%，生物膜检出阳性率并不高，说明临床分离的大多数的菌株可能是低毒性，或是源于正常菌群的污染。临床实践中，在考虑到宿主和环境的因素之外，能正确分析细菌是否形成生物膜，对于临床抗菌药物的选择，避免药物滥用显得尤为重要。如果实验室不能正确评价此类细菌在临床感染中的作用，势必会造成诊断和治疗的过度。

有鉴于此，临床实验室建立并常规进行凝固酶阴性葡萄球菌致病性的检测，对于鉴别污染，确定感染的真实性是十分必要和不容忽视的；通过细菌胞外多糖的鉴定和体外黏附性实验，再结合毒力基因 ica 的 PCR 扩增，可以较为准确地鉴定 CoNS 中致病性与非致病性的葡萄球菌，从而对临床凝固酶阴性葡萄球菌的正确诊断和合理治疗提供实验室依据，具有重要的临床意义。

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