于桂春， 王潇然， 侯晓华， 周珊珊， 张黎明

目前发现的血管平滑肌细胞(Vascular Smooth Muscle Cells，VSMC)钾通道主要有4种:电压依赖性钾通道(KV)、钙激活钾通道(KCa)、内向整流钾通道(Kir)和ATP敏感的钾通道(KATP)。其中KCa及KV在数量上要远多于后两者。钾通道对于VSMC的膜电位起着至关重要的调节作用，钾内流导致膜复极化，是保持静息膜电位的主要离子流。当VSMC膜去极化时，电压依赖性钙通道激活，胞外钙离子进入胞内，胞内游离钙离子浓度的升高最终可导致血管平滑肌的收缩［1］。因此，钾通道在血管平滑肌的舒缩和血管紧张度的维持机制中起着重要作用。钾通道的病理生理变化表现在许多血管高反应性相关的病理状态中，如:高血压、糖尿病、动脉粥样硬化［2］、蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛［3］等。钾通道也因而成为众多药物的作用靶点之一。酪氨酸激酶(Protein tyrosine kinase，PTK)抑制剂金雀异黄素(Genistein，GST)是一种来源于豆类植物的异黄酮类化合物，具有抑制肿瘤的生长和转移，预防心脑血管系统疾病和骨质疏松症的发生，以及弱的雌激素和抗雌激素等作用［4］。近年来研究发现GST对于离子通道也有快速的调节作用［5～10］。本实验通过膜片钳技术，检测GST对急性分离大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞(Mesenteric arterial smooth muscle cells，MASMC)的钾电流(IK)以及膜电位的影响，以探讨GST对钾通道的作用机制。

1 材料与方法

1.1 MASMC的制备 腹腔内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)以麻醉雄性Sprague-Dawley大鼠(体重150～250g)。取出肠系膜前动脉支配的全段肠系膜，置于生理盐溶液 (Physiological saline solution，PSS)(mmol/L;137 NaCl，5.4 KCl，0.44 NaH2PO4，0.42 Na2HPO4，4.17 NaHCO3，10 HEPES，通以 95%O2和5%CO2的混合气体，pH值7.4)中，在体式显微镜下剥离出肠系膜前动脉。将3级以下分支剪成长约2mm的小段并转移到装有2ml分离液A(PSS中含1.5mg/ml胶原酶/分散酶，0.5mg/ml弹性蛋白酶II-a，1mg/ml胰蛋白酶抑制剂I-s，2mg/ml胎牛血清)的离心管中37℃水浴孵育40min，而后将组织移到装有2ml分离液 B(PSS中含1mg/ml胶原酶，2mg/ml胎牛血清)的离心管中 37℃水浴孵育40min。经Pasteur管洗脱和吹打后，细胞悬液在含1%青霉素，链霉素的Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)中4℃培养4h，而后于含10%胎牛血清的DMEM中37℃培养备用。

1.2 膜电流及膜电位的记录 本实验全部采用全细胞膜片钳记录模式，在电流钳模式下记录膜电位，在电压钳模式下记录钾电流。全部实验在室温下进行(22℃)。膜片钳放大器为 Axopatch-1D(Axon Instruments)，通过 TL-1 DMA(Axon Instruments)进行数据采集，记录软件为pClamp，滤波为2 kHz，记录电极电阻为3～5 MΩ。电极内液 (mmol/L):130 KCl，10 HEPES，1 MgCl2，1 CaCl2，10 EGTA，2 Na2ATP以 KOH调节 pH值为7.2。细胞外液(mmol/L):130 NaCl，5.4 KCl，1.2 MgCl2，1.8 CaCl2，10 HEPES，10 Glucose，以 NaOH 调节 pH 值为7.4。记录钾电流时，钳制电位为 －70mV，从 －80mV至 +50mV，每个刺激持续 2s，每次递增10mV，刺激间隔为10s。

1.3 主要试剂 Genistein、Daidzein、tyrphostin25购自Calbiochem，配置成100mmol/L的二甲基亚砜储存液，试验中二甲基亚砜最终浓度小于0.1%。其他试剂购自Sigma公司。

2 结果

2.1 GST对IK的影响 在电压钳模式下，方波脉冲记录的电流可以被钾通道阻滞剂四乙胺(Tetraethylammonium TEA)显著抑制。从电流电压(I-V)曲线中可以看出，在刺激电位0-+50mV的区间内TEA(1mmol/L)可抑制记录电流达55%～80%，I-V曲线明显下移(P＜0.05)。TEA的抑制作用还呈现出快速可逆性以及浓度依赖性，表明所记录的电流为IK。GST(100μmol/L)可以快速可逆的抑制 IK(P ＜0.05)。tyrphostin25(10μmol/L)也可抑制IK(P＜0.05)，其作用与 GST类似，而 Daidzein(100μmol/L)对 IK没有显著影响(P ＞0.05)。

2.2 GST对IK作用的ATP依赖性 GST和tyrphostin 25对IK抑的制作用与细胞内的ATP密切相关。在电极内液不含 ATP的条件下，GST(100μmol/L)和tyrphostin 25(10μmol/L)对IK的影响没有统计学显著性(P＞0.05)。

2.3 GST对膜电位的影响 大鼠MASMC的静息膜电位值为 －45.8±2.5mV(n=15)。TEA 能去极化膜电位，其作用呈可逆性以及浓度依赖性，0.3mmol/L、1mmol/L、3mmol/L、10mmol/L 的 TEA可去极化膜电位至 －42.4±2.8mV、－41.2±1.8mV、－34.1±1.9mV、－22 ±3.1mV(P ＜0.05)。GST对膜电位的去极化作用也呈现出与TEA类似的可逆性以及浓度依赖性。10μmol/L、30μmol/L、100μmol/L的 GST可去极化膜电位至 －37.2±1.7mV、－29.85 ±1.65mV、－25.25 ±1.95mV(P ＜0.05)。 Daidzein (100μmol/L)、 tyrophostin25(10μmol/L)则对膜电位没有明显影响(P＞0.05)。

3 讨论

越来越多的研究发现，PTK能调节诸多离子通道活性，包括钙通道［11］、钠通道［12］、钾通道［13］、还有容量激活氯通道［14］。GST作为最常用的PTK抑制剂，也必然能影响离子通道的活性。有学者发现GST能增强人心房肌细胞容量敏感氯电流［5］，抑制大鼠心室肌细胞电压门控钾通道［6］，兔心室肌细胞钠电流［7］。然而GST对离子通道的作用机制仍存在争议，一些学者认为GST对离子通道的作用与其抑制PTK无关，而是GST直接影响离子通道的结果，其理由在于GST无活性的类似物Daidzein对离子通道也有与GST相似的作用。Weinreich等发现GST可以直接激活豚鼠心室肌细胞囊性纤维变性膜透性调节蛋白氯通道［8］。GST还可直接抑制兔冠状动脉平滑肌细胞钾电流［9］，豚鼠心室肌细胞钾电流［10］。我们研究发现，GST可以抑制大鼠MASMC的IK，而Daidzein对IK的抑制作用不显著，另一种PTK抑制剂tyrphostin25也可以抑制IK。由此可见，GST对大鼠MASMC的IK抑制作用缘于其对PTK的抑制。

ATP是细胞内蛋白磷酸化的重要底物，蛋白激酶就是将ATP的γ磷酸基转移到底物特定的氨基酸残基上，使蛋白质磷酸化的一类磷酸转移酶。当细胞内ATP缺失时，蛋白磷酸化就不能进行。我们发现当细胞内液不含ATP时，GST和tyrphostin25失去了对IK的抑制作用，这表明GST抑制IK的机制中还涉及蛋白磷酸化。

MASMC的4种钾通道中，KV通道在PASMC去极化时开放;KCa通道在MASMC细胞内钙离子浓度升高及细胞去极化时开放，对膜电位水平起负反馈调节作用。生理情况下只有KV通道开放以维持静息膜电位，而KCa通道处于关闭状态［15］。KV通道抑制剂可以使SMC显著去极化，KCa通道抑制剂则对静息膜电位没有明显影响［16］。TEA半数阻断KCa通道的浓度为 0.2mmol/L［16］，半数阻断 KV通道的浓度为3.1mmol/L［17］。因此低浓度的TEA对静息膜电位影响较小，高浓度TEA则可显著去极化膜电位，本实验结果也是如此。我们发现，尽管GST和tyrphostin25都可以抑制IK，但只有GST可以浓度依赖性去极化膜电位。表明GST抑制了KV通道，GST对其他钾通道是否也有抑制作用还不能确定，而tyrphostin25可能影响了KCa通道而对KV通道影响较小。GST和tyrphostin25作为酪氨酸激酶抑制剂，各自有着不同的作用底物。GST能抑制酪氨酸激酶pp60 V-SRC的活性，而对丝氨酸/苏氨酸激酶、PKA和PKC没有抑制作用;tyrphostin25则是受体酪氨酸激酶的抑制剂。因此我们推测GST通过抑制pp60 V-SRC的活性间接致使KV通道磷酸化，从而抑制了IK并使MASMC膜电位去极化。

总之，本实验研究了PTK抑制剂GST对大鼠MASMC的 IK的影响。结果发现GST和 tyrphostin25可以快速可逆的抑制IK，其作用与蛋白磷酸化相关。但仅GST可以浓度依赖性去极化膜电位，tyrphostin25对膜电位影响不显著。GST抑制IK是一个复杂的过程，除了抑制PTK活性外，还有哪些因子参与其中，最终使哪种钾通道失活，都需要进一步的研究探讨。

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