于彦婷，任丽，孙春玉，蒋世翠，王义，张美萍

人参SQE基因干扰载体的构建及转化

于彦婷，任丽，孙春玉，蒋世翠，王义，张美萍

目的探讨SQE基因对人参皂苷合成的影响。

方法根据SQE基因保守区序列，分别设计合成其正反义片段引物行 RT-PCR 扩增，扩增产物分别与 pMD18-T 质粒连接后转化E.coliDH5α，获得的 pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 重组质粒经双酶切后，将正反义片段与质粒 pMHZ112 反向连接，转化E.coliDH5α，构建SQE基因 RNAi 双元表达载体 pMHZ112-SQE。电击法将鉴定正确的重组质粒 pMHZ112-SQE 转化农杆菌 GV3101 感受态细胞，再利用农杆菌介导法转化人参愈伤组织，提取抗性人参愈伤组织细胞基因组 DNA，进行 PCR 检测并计算抗性愈伤转化率；同时提取人参皂苷，采用 HPLC 方法检测抗性人参愈伤组织的皂苷含量。

结果结果显示总 RNA 较完整无降解，质量较好；RT-PCR扩增产物正反义片段大小与预期一致；重组质粒pMD18-T-SQE-S、pMD18-T-SQE-A 和 pMHZ112-SQE 分别经双酶切进行测序鉴定，结果表明目的基因已插入重组质粒且连接方向正确。人参愈伤组织细胞基因组 DNA 的PCR 检测结果显示 1 个菌落经 2 对引物扩增结果均呈阳性，证明构建的 pMHZ112-SQE 重组质粒已成功整合入植物基因组中，其抗性愈伤转化率为 1%。转化 pMHZ112-SQE重组质粒后，人参抗性愈伤组织中单体皂苷 Rg1、Re、Rc 含量明显下降，Rb1 略有升高，实验组与对照组（转化空质粒）间 Rg1、Re、Rb1、Rc 的含量差异显著（均P＜ 0.05）；而 2 组均未检测出 Rb2 和 Rd。

结论成功构建了SQE基因 RNAi 双元表达载体，通过转化人参愈伤组织抑制SQE基因的表达，可以调控人参皂苷含量发生相应的改变。

人参； 基因； 药物载体； 皂苷类

鲨烯环氧酶（squalene epoxidase，SQE）是一种单加氧酶，它是三萜皂苷生物合成途径中的关键酶之一，其基因所编码的酶可催化鲨烯（squalene）生成 2,3-氧化鲨烯[1]。SQE 主要作用于单氧态氧化鲨烯生成 2,3-氧化鲨烯，2,3-氧化鲨烯是植物体内甾体、皂苷、倍半萜等许多萜类衍生物质的合成前体，这些物质在植物的生长发育或抗病过程中具有重要作用。据目前研究表明，SQE基因在不同物种中均有表达[2-4]。RNA 干扰（RNAi）主要是通过双链 RNA 的介导，特异性地降解相应序列的靶mRNA，从而阻断相应基因表达，是一种转录后水平的基因沉默方法[5]。为了进一步研究SQE基因在人参皂苷合成途径中的作用，本研究根据 RNAi原理，以SQE为靶基因，构建SQE基因植物高效 RNAi 双元表达载体，转化人参愈伤组织，进而分析转化前后单体皂苷含量的变化，以期为揭示人参中关键酶基因的功能、提高皂苷含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 5年生人参叶采自吉林省汪清县，并利用其诱导获得人参愈伤组织细胞。

1.1.2 菌株与质粒 大肠杆菌菌株E.coliDH5α和农杆菌 GV3101 均由吉林农业大学细胞工程实验室保存提供；pMD18-T 质粒购自天根生化科技（北京）有限公司；植物双元表达质粒 pMHZ112为本实验室自行构建。

1.1.3 主要试剂与仪器 总 RNA 提取剂（Trizol-A+）购自天根生化科技（北京）有限公司；第一链 cDNA 合成试剂盒、T4 DNA 连接酶购自富酶泰斯生物技术（深圳）有限公司；限制性内切酶XbaI、BamHI、XhoI、HindIII 购自宝生物工程（大连）有限公司；其他生化试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。梯度 PCR 仪和恒温金属浴均购自杭州博日科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考注册的五加科植物鲨烯环氧酶基因 AB003516、AB122078、FJ393274、EU131089、DQ457054、DQ386734 序列进行比对，找到SQE基因的保守区域位于 1135 ～1469 bp。然后根据其保守区的基因信息，应用引物设计软件 DNA star 和 NTI9.0 设计人参 SQE 干扰片段的引物，同时根据载体的多克隆位点及应用Primier5.0 对片段进行酶切位点分析后，在正义片段 S 上下游引物中分别引入XbaI、BamHI 酶切位点，反义片段 A 上下游引物中分别引入XhoI、HindIII 酶切位点。其中正义片段 S 上游引物 S1序列为 5’ TGCTCTAGACACTTTTATTAGGGGAT GC 3’，下游引物 S2 序列为 5’ CGCGGATCCAAG AAGTGGAGAAATAGGC 3’；反义片段 A 上游引物 A1 序列为 5’ CCGCTCGAGCACTTTTATTAG GGGATGC 3’，下游引物 A2 序列为 5’ CCCAAGC TTAAGAAGTGGAGAAATAGGC 3’；丙酮酸脱氢酶激酶内含子（PDK Intron）上游引物 P1 序列为5’ AGCGAATTCTAGTATAAAATAGTTAAGTG 3’，下游引物 P2 序列为 5’ ATGGAATTCCAATCCAA ATGTAAGATC 3’。引物均由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.2.2SQE基因 RNAi 双元表达载体的构建 构建策略见图 1。利用 Trizol 法提取人参叶总RNA，反转录合成 cDNA。以 cDNA 为模板，分别以 S1/S2 和 A1/A2 为引物，通过 RT-PCR 方法克隆SQE基因正义及反义片段，然后在 T4 DNA 连接酶作用下分别与 pMD18-T 质粒连接，转化E.coliDH5α，获得SQE基因正反义干扰片段，经双酶切后测序鉴定正确的质粒分别命名为 pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A。提取pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 质粒，分别用XbaI、BamHI 和XhoI、HindIII 双酶切正反义片段及质粒 pMHZ112，回收相应 DNA 片段，用T4 DNA 连接酶将正反义片段与质粒 pMHZ112反向连接，连接后的载体转化E.coliDH5α，置于5 ml含 15 mg/L 四环素的 LB 培养基中，37 ℃、倒置培养过夜，挑取单菌落进行 PCR 鉴定。将转化大肠杆菌成功的重组质粒命名为 pMHZ112-SQE，并利用 PDK 引物进行方向性鉴定。

图 1 SQE基因RNAi双元表达载体构建示意图Figure 1 Schematic diagram of RNAi binary expression vector construction of SQE genes

1.2.3 转化农杆菌侵染人参愈伤组织 利用电击法将鉴定正确的重组质粒 pMHZ112-SQE 转化农杆菌 GV3101 感受态细胞，将转化后细胞置于含有 15 mg/L 四环素的 LB 固体平板中，28 ℃ 倒置培养 2 ～ 3 d 后，挑取单菌落进行 PCR 鉴定。将人参愈伤组织加入装有农杆菌菌液（A550值为 0.6）的三角瓶中，侵染 8 ～ 10 min 后转移至含有0.5 mg/L 苄氨基嘌呤（BA）、0.1 mg/L 萘乙酸（NAA）的 MS 培养基中共培养，23 ℃ 暗培养3 d 后，再转入含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、400 mg/L头孢霉素（Cef）的 MS 抑菌培养基中，23 ℃ 暗培养 7 d，每 2 d 更换 1 次培养基。最后转至含有 0.5 mg/L BA、0.1 mg/L NAA、20 mg/L 卡那霉素（Kan）的 MS 筛选培养基中，每隔 7 d 更换 1 次培养基，筛选抗性人参愈伤组织细胞。

提取阳性人参愈伤组织细胞基因组 DNA，分别用引物 S1/P2 和 A2/P1 进行 PCR 扩增，并取扩增产物行琼脂糖凝胶电泳。1 个菌落经 2 对引物扩增结果均呈阳性，则证明构建的 pMHZ112-SQE 重组质粒已成功整合入植物基因组中。同时选择 3 个批次稳定生长的阳性人参愈伤组织细胞，每个批次分别随机抽取 20 瓶进行 PCR 验证后，计算抗性愈伤转化率。

1.2.4 皂苷含量测定 选择 PCR 检测呈阳性的人参愈伤组织，按照参考文献[6]以索氏提取法提取人参皂苷。实验分为转化 pMHZ112-SQE 重组质粒的实验组和转化 pMHZ112 空质粒的对照组，采用 HPLC 方法，测定人参皂苷中 6 种主要单体皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，并比较分析各单体皂苷的含量差异。HPLC 色谱条件：Hypersil-C18 色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）；水-乙腈（41∶9）流动相；柱温 35 ℃，检测波长203 nm，进样量 20 µl，流速为 1.3000 ml/min；采用梯度洗脱方式。

1.3 统计学处理

应用 SPSS16.0 统计学软件进行数据处理，各组单体皂苷含量的比较采用方差分析，以P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 正反义片段 SQE-S 和 SQE-A 的克隆与鉴定

以 5年生人参叶片为材料提取总 RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示 28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA 特征条带清晰，表明总 RNA 比较完整无降解，质量较好，符合后续功能基因克隆、表达的要求（图 2）。

图 2 人参总 RNA 琼脂糖凝胶电泳分析Figure 2 Agarose gel electrophoresis analysis of ginseng total RNA

利用提取的总 RNA，经反转录合成 cDNA 模板，分别以 S1/S2 和 A1/A2 为引物 PCR 扩增SQE 基因正义片段 S 与反义片段 A，经琼脂糖凝胶电泳检测在 364 bp 处均可见单一明显特异性条带，与预期的 DNA 表达片段大小一致（图 3）。

图 3 SQE 基因正义片段 S 与反义片段 A 的 PCR 扩增Figure 3 The results of sense-S and the antisense-A by PCR amplification

pMD18-T-SQE-S 和 pMD18-T-SQE-A 分别经双酶切后进行测序鉴定，结果分别可见大小约为364 bp 和 2700 bp 的SQE基因正反义片段和pMD18-T 质粒条带，证明目的基因已插入重组质粒，测序结果与预期一致（图 4、5）。

图 4 pMD18-T-SQE-S 重组质粒的双酶切鉴定Figure 4 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-S by double restriction enzyme digestion

图 5 pMD18-T-SQE-A 重组质粒的双酶切鉴定Figure 5 Identification of recombinant plasmid pMD18-TSQE-A by double restriction enzyme digestion

2.2 双元表达载体 pMHZ112-SQE 的构建

将 pMHZ112-SQE 重组质粒分别用限制性内切酶XbaI 与HindIII、XhoI 与BamHI 双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后分别可见大小约为 1 kb 和28.1 kb 的 S/A+PDK 和 pMHZ112 质粒条带，表明SQE基因连接方向正确，pMHZ112-SQE 重组质粒构建成功（图 6）。

2.3 pMHZ112-SQE 转化人参愈伤组织的PCR检测

提取阳性人参愈伤组织细胞基因组 DNA，经PCR 扩增后行琼脂糖凝胶电泳，结果显示 1 个菌落经 2 对引物扩增结果均呈阳性（图 7）。对 3 个批次阳性人参愈伤组织细胞的检测结果表明，抗性愈伤转化率为 1%。

图 6 pMHZ112-SQE 重组质粒的双酶切鉴定Figure 6 Identification of recombinant plasmid pMHZ112-SQE by double restriction enzyme digestion

图 7 pMHZ112-SQE 重组质粒转化人参愈伤组织的 PCR检测Figure 7 The PCR detection of ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

图 8 pMHZ112-SQE 重组质粒转化人参愈伤组织中 6 种单体皂苷的含量Figure 8 The content of 6 saponin monomer in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

2.4 pMHZ112-SQE 转化人参愈伤组织的皂苷含量

提取阳性人参愈伤组织的人参皂苷，HPLC 法测定 6 种主要单体皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rd 的含量，结果在转化空质粒和 pMHZ112-SQE重组质粒的人参愈伤组织中均检测出 Rg1、Re、Rb1、Rc 这 4 种单体皂苷，并且与阴性对照组相比，实验组 Rg1、Re、Rc 的含量大幅度下降，而Rb1 的含量则略有增加；但两组均未检测出 Rb2和 Rd 这 2 种单体皂苷（图 8）。由此可见，通过RNAi 干扰抑制SQE基因的表达，可以使人参单体皂苷含量发生相应的改变。

利用 SPSS16.0 统计学软件对转化空质粒与转化 pMHZ112-SQE 重组质粒的人参愈伤组织中皂苷含量进行差异性分析，结果显示 2 组间单体皂苷 Rg1、Re、Rb1、Rc 含量差异显著（均P＜0.05），而 Rb2、Rd 在 2 组中含量均为 0，不存在差异（表 1）。

表 1 pMHZ112-SQE 重组质粒转化人参愈伤组织中皂苷含量的差异性分析Table 1 The difference analysis of saponin monomer content in ginseng callus transformed by recombinant plasmid pMHZ112-SQE

3 讨论

人参的次生代谢十分复杂，至今为止虽然不断有相关报道，但人参皂苷的合成途径尚不清楚。SQE是皂苷合成途径过程中最后一个通用酶[7]，在随后的催化反应中可产生植物激素、植物甾醇或皂苷三萜类化合物，其基因所编码的酶催化鲨烯生成的2,3-氧化鲨烯，在经过一系列的质子化、环化、重排和去质子化作用后可形成三萜皂苷元[8]。

SQE 是人参皂苷合成途径中的关键酶之一，理论上通过抑制SQE基因的表达，可使人参皂苷的含量有所降低。本研究结果表明，RNA 干扰后人参单体皂苷 Rg1、Re、Rc 含量下降，而 Rb1 的含量则有所升高，其原因可能是 RNA 干扰的不彻底，由于干扰时存在底物的竞争性，从而导致干扰后含量的增加；其次，干扰效果还受转化材料的限制，转化的人参愈伤组织比较松散，除菌不够彻底，可能存在部分假阳性现象；再次，RNA 干扰是一个复杂的过程，是多基因协同作用的结果，人参皂苷合成也是一个复杂的过程，其相关酶与相关酶之间、相关酶与皂苷之间相互联系、相互作用，只抑制某一单基因的表达，对次生代谢终产物含量不会有显著影响。

总之，本研究在成功构建SQE基因 RNAi 双元表达载体的基础上，通过转化人参愈伤组织检测分析表明 RNAi 可使人参单体皂苷含量发生相应的改变，为了解皂苷合成中关键酶和皂苷合成的相关机制奠定了理论基础。

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www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2011, 6(2):121-126

The construction and transformation of GinsengSQEgene interference vector

YU Yan-ting, REN Li, SUN Chun-yu, JIANG Shi-cui, WANG Yi, ZHANG Mei-ping

ObjectiveTo explore the effects ofSQEgene on ginsenoside synthetic.

MethodsAccording to the conservative region sequence ofSQEgene, primers of the sense and antisense fragments were designed and synthetized respectively for RT-PCR, and the amplification products were connected with plasmid pMD18-T, then transformed into theE.coliDH5α.After the obtained recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S, pMD18-T-SQE-A were double-enzyme digested,the sense and antisense fragments were subsequently inserted reversely to plasmid pMHZ112, then transformed intoE.coliDH5α to construct the pMHZ112-SQE, which was the RNAi binary expression vector ofSQEgene.The correctly identified recombinant plasmid pMHZ112-SQE was transformed into the GV3101 Agrobacterium competent cells by electrotransformation, then transformed the ginseng callus by Agrobacterium-mediated approach.The genomic DNA of resistant ginseng callus were extracted for PCR, and calculated resistance ginseng callus transformation ratio; Simultaneously, the ginsenosides were extracted to detect the ginsenosides content of resistance ginseng callus by HPLC.

ResultsRT-PCR result showed that the total RNA was intact and had better quality without degradation; the sense and antisense PCR amplification fragments were consistent with the expected sequences.After the recombinant plasmids pMD18-T-SQE-S,pMD18-T-SQE-A and pMHZ112-SQE were identified by double restriction enzyme digestion, the results showed that the target gene was inserted into the recombinant plasmid with correct orientation.The PCR results of ginseng callus genomic DNA showed that the amplification results of one colony with two pairs of primers were all positive, proving that the recombinant plasmid pMHZ112-SQE was integrated into the plant genome successfully, and the transformation ratio of resistant ginseng callus was 1%.After transformation of the recombinant plasmid pMHZ112-SQE, the contents of monomer saponin Rg1、Re、Rc were measurablly reduced,and Rb1 was insignificant increased in resistance ginseng callus.The contents of Rg1、Re、Rb1、Rc between experimental group and control group (transformed by empty plasmid) had significant difference (P＜ 0.05); and neither of them showed detectable monomer saponin Rb2 and Rd.

Conclusion The RNAi binary expression vector ofSQEgene was constructed successfully, and the ginsenosides content could be controlled accordingly by inhibiting the expression ofSQEgene in ginseng callus.

GINSENG; Genes; Drug carriers; SAPONINS

ZHANG Mei-ping, Email: wzhaoyun@tom.com

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2011, 6(2):121-126

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.02.008

130118 长春，吉林农业大学生命科学学院细胞工程实验室

张美萍，Email：wzhaoyun@tom.com

2011-01-11

Author Affiliation: Cell Engineering Laboratory of Life Science College, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

·综述·