刘小丽，薛晓鸥*，唐炳华，牛建昭

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学基础医学院科研中心，北京 100029）

大豆苷元对HEC-1B细胞增殖及雌激素受体报告基因表达的影响

刘小丽1，薛晓鸥1*，唐炳华2，牛建昭2

（1.北京中医药大学东直门医院，北京 100700；2.北京中医药大学基础医学院科研中心，北京 100029）

目的 探讨大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响及其对雌激素受体报告基因表达的影响。方法 体外培养子宫内膜癌细胞子宫内膜癌雌、孕激素受体阴性细胞系（HEC-1B），采用四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测不同浓度大豆苷元对子宫内膜癌细胞增殖的影响，同时检测大豆苷元对雌激素应答原件（ERE）调控的雌激素受体α（ERα）和雌激素受体β（ERβ）的荧光素酶报告基因表达的影响。结果 大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用,差异有统计学意义（P＜0.01），其抑制作用有明显量效和时效性特征。在浓度为20～80×10-6mol/L的大豆苷元作用下，报告基因luc的表达较正常对照组明显提高,差异有统计学意义（P＜0.05），在80×10-6mol/L时到达最高值；大豆苷元通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα，差异有统计学意义（P＜0.01）。结论 大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞ERα和ERβ介导的报告基因的表达，调整ERα/ERβ比例，从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

大豆苷元；子宫内膜癌；细胞增殖；雌激素受体；四甲基偶氮唑盐法；报告基因

植物雌激素是一类结构和功能与雌激素相似的而源自植物的化合物，它具有与雌激素相似的酚环结构，能选择性地与雌激素受体结合，而选择性地发挥弱雌激素样和抗雌激素样活性。随着植物雌激素的发现，人们开始着力研究对其子宫内膜癌的治疗作用。大豆苷元是一种常见的植物雌激素之一，存在广泛，但对于大豆苷元的抗肿瘤及受体调节作用尚缺乏深入研究。本文就大豆苷元对HEC-1B细胞的体外抗增殖作用及受体调节作用进行研究，旨在探讨大豆苷元的抗肿瘤及其双向受体调节作用活性。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系与质粒 人子宫内膜癌细胞系HEC-1B细胞，购自协和医科大学基础医学院细胞中心，传代培养。β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-gal）对照质粒pβ-gal-control购自CLONTECH 公司。重组报告基因载体pERE-TAL-luc是将5×ERE序列插入pTAL-luc质粒的多克隆位点（MCS）构建的重组报告基因载体质粒，由北京迪安生物科技有限公司构建合成。重组人ERα表达载体pCXN2-hERα和重组人ERβ表达载体pCXN2-hERβ由东京大学老年医学系Satoshi Inoue博士惠赠，它们分别是将 hERα 的互补 DNA（complememtary DNA，cDNA）和 hERβ的 cDNA插入到pCXN2载体 MCS的EcoRI酶切位点构建而成的。

1.1.2 药物 大豆苷元：北京中医药大学细胞与生化实验室提供，纯度99.8%，分子量为270.2。

1.1.3 试剂 NEAA培养液和无酚红DMEM培养基、胰蛋白酶及乙二胺四乙酸(EDTA)购自北京迈辰公司生产；OPTI-MEM 1培养基购自Gibico公司；胎牛血清和无雌激素活性炭处理的胎牛血清购自Hyclone公司；二甲基亚砜(DMSO)、17β-雌二醇（17β-estrodiol，E2）购于 Sigma 公司；脂质体 lipofectamineTM 2000 Reagent购自Invitrogen公司；荧光素酶阳性对照 药（Quantilum Recombinant Luciferase）、Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（Steady-GloLuciferaseAssay System）、闪亮裂解缓冲液（Glo Lysis Buffer）、质粒提取试剂盒（plamid Minikit）、β-gal检测试剂盒购自Promega公司；胰蛋白胨、酵母粉购自DIFCO公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.4 仪器 CO2培养箱 （MCO-18AIC， 日本SANYO公司）；倒置显微镜（日本尼康公司，型号：TS100）；生化培养箱（上海医疗器械公司，型号：HH-941）；水浴振荡器（HZS-H型）；高速冷冻离心机（Sigma公司， 型号：3K15）； 多功能酶标仪（瑞士TECAN 集团公司，型号：SAFIRE2）；分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司，型号：AE163）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HEC-1B细胞培养在含有10%胎牛血清的NEAA培养液中，于37℃、5%CO2培养箱内培养至贴壁生长，根据细胞生长状况2～3 d换液或传代1次。

1.2.2 细胞接种 将处于对数生长期的HEC-1B细胞接种于24孔板，密度为2.0×105个/0.5 mL/孔，且培养液为无抗生素、含10%CDT-FBS的无酚红NEAA培养液，分别设置正常对照孔、待测药物孔，各组均设3个重复孔，实验重复3次。

1.2.3 MTT实验 选用对数生长期的HEC-1B细胞，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA进行消化，用无抗生素、含10%CDT-FBS的无酚红NEAA培养液配成细胞悬液，以104个/mL的浓度接种于96孔板内，每孔体积为100 μL（即每孔细胞数位1 000个），每组取6个复孔。待细胞贴壁后（24 h后），吸去孔内培养上清液，用1×PBS冲洗1次，加入不同浓度（20、40、80、160、320×10-6mol/L）的大豆苷元，每个浓度为 6个重复孔，同时用含10%CDT-FBS的无酚红NEAA培养液做空白对照：将培养板放入CO2孵箱中，在37℃、5%CO2及95%湿度条件下，连续培养24～96 h。每隔24 h，取其中1块板加MTT 溶液20 μL，置37℃继续培养4 h，终止培养后小心吸去孔内培养上清液，每孔加入200 μL DMSO，振荡器振荡10 min，使结晶充分溶解；选择490nm波长在酶联免疫检测仪上测各孔的光吸收值，以空白孔调零，按下列公式计算细胞生长的抑制率。实验重复3次。

抑制率%=（对照孔测定的平均OD值－加药组测定的平均 OD值）/对照孔测定的平均 OD值×100%

1.2.4 报告基因法检测大豆苷元对ERE调控的荧光素酶报告基因表达 于转染前24 h将处于对数生长期的HEC-1B细胞接种于24孔板，密度为2.0×105个/（0.5 mL·孔），且培养液为无抗生素、含10%CDT-FBS的无酚红NEAA培养液，分别设置正常对照孔和待测药物孔，各组均设3个重复孔，实验重复3次。于细胞接种24 h后进行质粒的转染实验。在不同的EP管中分别加入无血清、无抗生素的OPTI-MEM I 培养基各 50 μL， 分别加入 0.8μg pERE-TAL-luc、0.1μg β -gal-control、0.1μg pCXN2-hERα 或 0.1μg pCXN2-hERβ 质粒 DNA；在另一EP管中，用不含抗生素、不含血清的OPTIMEM I培养基稀释脂质体，孵育5 min后将其加入质粒转染混合物中，轻轻混匀，并使脂质体的终浓度为2.8 μL/100 μL培养液。常温孵育20 min后，将DNA转染混合物缓缓加入24孔板中的HEC-1B细胞培养液内，前后轻轻摇匀，置37℃培养箱中。6 h后，向各孔内加入不同受试物，分别包括：0.1%DMSO、一定浓度的大豆苷元，置于37℃常规培养24 h。于加药后48 h取出培养板，小心吸出培养液，加入细胞裂解液150 μL，常温裂解5 min。luc活性按照steady-Glo稳定荧光素酶检测系统试剂盒（Steady-Glo luciferaze Assay System）说明进行检测：于96孔板中加入不同样品裂解液各100 μL，分别加入等量luc检测底物，室温避光5 min后，于多功能酶标仪上读取荧光值。β-gal活性测定也依据试剂盒说明书进行：于96孔板中加入不同样品裂解液各50 μL，加入等量检测底物并于37℃孵育30～40 min后在酶标仪上读取A420值，根据结果计算各样品的标准化荧光素酶活性（荧光值/A420值）。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析，以“”表示，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖作用的量效关系

采用不同浓度大豆苷元作用于HEC-1B细胞24 h后，结果显示，大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖有明显抑制作用，差异有统计学意义（P＜0.01），抑制作用随药物浓度增加更为明显，在一定浓度范围内呈浓度依赖性关系。见表1。

2.2 大豆苷元对HEC-1B细胞体外增殖作用的时效关系

大豆苷元对HEC-1B细胞的抑制作用的半抑制率（IC50）为 160×10-6mol/L 左右，因此选择 160×10-6mol/L进行大豆苷元的时间依赖性研究。结果显示，大豆苷元对HEC-1B细胞的体外增殖抑制作用随作用时间增加而加强，差异有统计学意义（P＜0.05），72 h后抑制率达到最高值，此后抑制作用逐渐减弱。见表2。

表1 大豆苷元作用于HEC-1B细胞24 h量效关系（，n=6）

表1 大豆苷元作用于HEC-1B细胞24 h量效关系（，n=6）

注：与正常组比较▲P＜0.01。

浓度(10-6mol/L)正常组20 40 80 160 320吸光度值0.31±0.01 0.27±0.02▲0.24±0.03▲0.21±0.02▲0.19±0.04▲0.09±0.06▲抑制率(%)0 15.21 21.91 32.52 49.14 71.72

表2 大豆苷元作用于HEC-1B细胞时效关系（，n=6）

表2 大豆苷元作用于HEC-1B细胞时效关系（，n=6）

注：与 48 h 比较▲P＜0.01；与 72 h 比较△P＜0.05。

时间（h）24 48 72吸光度值（160×10-6mol/L）0.16±0.11▲△0.14±0.24△0.15±0.30抑制率(%)49.31 58.12 60.21

2.3 大豆苷元对ERE调控的荧光素酶报告基因表达的影响

大豆苷元诱导报告基因表达的结果均为luc荧光测定值与β-gal吸光度测定值的比值，即已去除了转染效率上的差异对测定的影响。用pgal-control、pTAL-ERE-luc及 ERα 或 ERβ 共转染HEC-1B细胞后经大豆苷元诱导48h，结果表明：大豆苷元浓度为20×10-6mol/L时已可显著诱导ERα和ERβ报告基因的表达，luc活性值与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），其诱导作用在80×10-6mol/L时到达最高值，其后逐渐下降；与10-8mol/L浓度的E2诱导组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示大豆苷元诱导ERα和 ERβ报告基因 luc表达的强度不及 E2。见表 3。

2.4 大豆苷元对ERE调控的ER-α、ER-β荧光素酶报告基因表达的影响

不同浓度大豆苷元对ERα、ERβ报告基因表达的影响，将相应浓度下分别测得的ERα或ERβluc活性值减去ERα和ERβ两组正常对照组的共同平均luc活性值，得出ERα、ERβ荧光素酶报告基因各自变化值，再通过比较不同作用浓度下ERα、ERβ荧光素酶报告基因的变化值来观察大豆苷元对ERE调控的ERα、ERβ荧光素酶报告基因表达的影响。从结果中可以看出，大豆苷元在40～80×10-6mol/L作用浓度下，ERβ的luc活性变化值明显大于ERα的luc活性变化值，差异有统计学意义（P＜0.01），提示通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度强于ERα。见表4。

表3 不同浓度大豆苷元对ERE调控的荧光素酶报告基因表达Luc活性的影响 （，荧光强度/A420）

表3 不同浓度大豆苷元对ERE调控的荧光素酶报告基因表达Luc活性的影响 （，荧光强度/A420）

注：与正常组比较▲P＜0.01，△P＜0.05；与雌二醇组比较 *P＜0.01，﹟P＜0.05。

组 别正常对照雌二醇大豆苷元大豆苷元大豆苷元大豆苷元浓度（mol/L）0 10-8 20×10-6 40×10-6 80×10-6 160×10-6 ER-α 305.09±44.61 11 784.08±12.71▲6 348.11±28.90▲*7 085.24±78.91▲*7 951.26±54.64△*1 116.34±16.35▲*ER-β 4 068.16±43.91 22 552.16±468.63▲11 860.12±405.04△*12 958.21±113.51▲*15 566.08±134.21▲#900.52±8.03▲*

表4 大豆苷元对ERE调控的ER-α、ER-β荧光素酶报告基因表达Luc活性变化值的影响 （，n=3）

表4 大豆苷元对ERE调控的ER-α、ER-β荧光素酶报告基因表达Luc活性变化值的影响 （，n=3）

注：与 ER-α 相比▲P＜0.01。

组别(10-6mol/L)正常组20 40 80 ER-α-508.21±44.63 2 787.23±28.91 3 523.31±78.91 4 420.21±54.61 ER-β 507.81±43.91▲8 299.21±404.04 9 397.20±114.34▲12 005.00±114.12▲

3 讨论

近年来，植物雌激素在抗癌、防癌方面的功效备受关注。流行病学调查显示[1-2]，摄取豆类食品相对多的地区乳腺癌等疾病的发病率明显降低。我国一项对上海117名绝经期妇女的前瞻性对照研究表明，摄入豆类食品量及小便中异黄酮含量与乳腺癌的发病率呈负相关[3]。XU[4]等的基于人群学研究表明，经常摄入豆类食品可有效降低子宫内膜癌的发病。然而，关于以大豆苷元为代表的植物雌激素对于子宫内膜癌的防治作用的报导较少，其具体机制还有待进一步阐明。

子宫内膜癌是一种激素依赖性肿瘤，它的发生与雌激素的长期刺激和缺乏孕激素的有效拮抗有密切关系。雌激素的作用发挥与雌激素受体（ER）关系密切。雌激素是通过与其具有高度亲和力的ER结合，从而引发相关基因的改变和基因编码产物的生成，导致子宫内膜癌的发生，此即是经典的E-ER学说。ERα和ERβ在子宫内膜从良性病变到癌前病变再到癌的进展过程中都起了重要的作用，ERα、ERβ的平衡失调在子宫内膜癌的发生过程中起着更为重要的作用[5]。子宫内膜的增殖作用主要是通过ERα途径介导而成[6]，ER β的确切作用不明,但体外研究表明在不饱和雌激素水平下，ERβ是 ERα作用的抑制剂，并且ERβ降低了所有细胞对雌激素的敏感性，是决定细胞对雌激素及雌激素拮抗剂作用的关键[7-8]。

大豆苷元是植物雌激素的主要成分之一，研究发现大豆苷元能抑制Ishikawa细胞体外增殖[9]，认为大豆苷元扮演着选择性雌激素受体调节剂的角色[9]。本研究通过体外实验发现，大豆苷元可明显抑制子宫内膜癌HEC-1B细胞的体外增殖，其抑制作用随药物浓度的增加及作用时间的延长而明显加强，在一定浓度和时间范围内存在剂量和时间依赖性，由此可推断大豆苷元具有一定的抗肿瘤活性，亦为临床上运用植物雌激素防治子宫内膜癌提供了理论依据。

有研究表明，当体内雌激素水平低下时，大豆苷元发挥弱雌激素样作用；同时它又能与雌激素竞争雌激素受体，因而具有抗雌激素作用。薛晓鸥等[10]研究结果表明,以金雀黄素为代表的大豆异黄酮类植物雌激素，对Ishikawa细胞ERαmRNA和ERβmRNA的表达的调节作用与其剂量有一定关系,即低剂量时能提高ERαmRNA和ERβmRNA的表达,高剂量时能抑制或不提高ERαmRNA和ERβmRNA的表达，推测大豆苷元有雌激素受体调节剂的作用。本实验选择雌、孕激素受体均为阴性的人子宫内膜癌细胞系HEC-1B细胞为研究对象，采用质粒转染和报告基因检测的方法，研究了不同浓度大豆苷元对HEC-1B细胞雌激素受体ERα和 ERβ的表达的影响。结果显示：大豆苷元浓度为20×10-6mol/L时已可显著诱导报告基因luc的表达，其诱导作用在80×10-6mol/L时达到最高值，其后逐渐下降，但其诱导报告基因luc的表达升高强度不及E2；此外，也可以看出，大豆苷元通过ERβ介导的报告基因表达水平的升高程度高于通过ERα介导的报告基因表达水平。基于此研究结果，我们推测：大豆苷元可通过调节子宫内膜癌细胞ERα和 ERβ的表达，调整ERα/ERβ比例，进而改变下游靶基因的表达，从而抑制子宫内膜癌细胞的增殖，这与临床运用孕酮抑制子宫内膜癌细胞生长机制部分一致。

子宫内膜癌发病是多基因、多步骤的发展过程,其作用机制十分复杂。大豆苷元具有明显抗肿瘤的作用,并且细胞毒性低于常规抗癌药,因此，大豆苷元抗子宫内膜癌的治疗有着广阔的前景，其具体的临床运用价值值得我们更深入的研究。

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［10］薛晓鸥,魏丽惠.金雀黄素对子宫内膜癌细胞ER α和ER β mRNA水平的调节[J].北京大学学报，2005,37(3):278-279.

（本文编辑 彭芝配）

Effect of Daidzein on expression of fluorescein gene regulated by ERE in HEC-1B

LIU Xiao-li,XUE Xiao-ou,TANG Bing-hua,NIU Jian-zhao
(Dongzimen Hospital,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China)

Objective To study the effect of daidzein on the proliferation of endometrial carcinoma in uterus and its mechanism.Methods Endometrial carcinomacell HEC-1B were cultured in vitro,the influences of genintein in different doses on the proliferation of HEC-1B cell were detected by MTT method,and the expression of luciferase reportor gene of ERα and ERβ effected by ERE were evaluated.Results Daidzein inhibited significantly the proliferation of HEC-1B cells in vitro(P＜0.01)and the effect was streghtened along with the increase of the dose and the prolong of action time. Under the control of daidzein concentration 20～80×10-6mol/L,the expression of reporter gene luc was increased compared with control group(P＜0.05)and reached the highest point in the concentration 80×10-6mol/L;the increase of reporter gene expression induced by ERβ was stronger than that induced luc expression either through ERα (P＜0.01).Conclusion Daidzein can inhabit the proliferation endometrial carcinoma through regulating the expression of ERα or ERβ,and regulating the balance of ERα/ERβ.

daidzein;endometrial caicinoma;proliferation;estrogen receptor;reporter gene

*薛晓鸥，女，教授，博士研究生导师，主任医师，E-mail：xxo123@sina.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2011.01.007.025.05

2010-10-26

国家科技部“十一五”支撑项目（2003BAI11B07-02）；首都医学科技发展基金（F-2007-III-11）。

刘小丽（1976-），女，湖南邵阳人，医学博士，主治医师，研究方向为妇科肿瘤与内分泌。