史 怀， 肖马云， 刘 波

(福建省农业科学院农业生物资源研究所， 福建 福州 350003)

固定化细胞技术是指将微生物细胞、酶类、抗体以及蛋白质包埋在某些天然或有机合成材料形成的颗粒内部的一种生物技术。经固定化的细胞可在颗粒内部增殖，免受苛刻环境条件的影响，在一定条件下能从颗粒内部释放出来[1]。固定化细胞凭借其优良性能已被应用于医药、环保、食品工业等领域。研究人员将某些聚合物包埋细菌制成微生物接种剂，应用在农业领域，为开发微生物菌剂的新载体探索出了一条新途径[2-3]。国内的相关研究显示，包埋固定化的细菌肥料有保存期长、不容易受环境污染等优点，引起了广泛关注。

淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus(Thom) Samson属丝孢菌目拟青霉属，对多种植物寄生线虫有着良好的防治效果，此外还具有杀虫、促长、拮抗、降解等多种功效，是极具推广潜力的生防菌与功能菌[4]。前人对淡紫拟青霉制剂的研究较多，但对淡紫拟青霉的固定化研究则尚未见报道。本试验对淡紫拟青霉的固定化包埋条件进行了初步研究，旨在为淡紫拟青霉固定化微生物制剂工艺的实际应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 淡紫拟青霉FJAT-9041菌株由本课题组自行分离保存。

1.1.2 培养基 查氏培养基含3 g NaNO3、1 g K2HPO4、0.5 g KCl、0.5 g MgSO4·7H2O、0.01 g FeSO4、30 g蔗糖、1000 mL H2O，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养 淡紫拟青霉FJAT-9041菌株于28 ℃、110 r·min-1摇床发酵7 d，孢子终含量为2.0×107cfu·mL-1。

1.2.2 固定化小球的制备 本试验选用4组材料进行包埋，制备方法如下。

海藻酸钠包埋：在4%海藻酸钠中加入1/10体积的淡紫拟青霉发酵液，混合均匀后用10 mL注射器以恒定速度滴至10% CaCl2中。

聚乙烯醇包埋：在10%聚乙烯醇中加入1/10体积的淡紫拟青霉发酵液，混合均匀后用10 mL注射器以恒定速度滴至用NaCO3调节pH为6.7的含2% CaCl2的饱和硼酸中。

明胶包埋：将淡紫拟青霉发酵液与5-10 ℃的10%明胶按1∶1的比例混合均匀，用10 mL注射器以恒定速度滴至4% CaCl2中。

海藻酸钠—明胶混合包埋：将淡紫拟青霉发酵液与2%海藻酸钠、2%明胶按1∶1∶1的比例混合均匀，放入冰箱冷却至5-10 ℃，用10 mL注射器以恒定速度滴至4% CaCl2中。

以上操作均在无菌条件下进行，获得的固定化细胞小球在溶液中常温固化2 h，无菌水洗涤后用无菌水浸泡置4 ℃下保存。

1.2.3 机械性能的测试 直径的测量：随机挑取20个固定化小球，用游标卡尺测量直径并计算平均值。

机械强度的测量：分别用100 g砝码加压20个固定化小球，用游标卡尺测量每个固定化小球的直径并计算平均值。

检验小球是否合格的方法：用100 g砝码加压不易破裂且无菌液流出；将固定化小球摔打在桌子上，很容易弹起，说明合格。

1.2.4 活菌数的测定 保存7 d后，取1 g固定化小球，用0.2 mol·L-1无菌柠檬酸钠溶液溶解，稀释涂板，于28 ℃恒温箱培养5 d，统计淡紫拟青霉的活菌数，以淡紫拟青霉发酵液为对照。

1.2.5 包埋条件的优化 固定其他条件不变，分别设置淡紫拟青霉发酵液含量为10%、15%、20%、25%、30%，海藻酸钠含量为1%、3%、5%、7%、9%，CaCl2含量为8%、10%、12%、14%、16%，包埋时间1、2、3、4、5 h，进行单因素优化试验，每个处理均设3个重复。

1.2.6 淡紫拟青霉在固定化小球中存活能力的测定 固定化小球加少量无菌水置4 ℃的冰箱中保存，分别在10、30、60 d取样，测定活菌数，以未固定化的淡紫拟青霉发酵液为对照。

2 结果与分析

2.1 包埋材料的筛选

从表1、图1可见：海藻酸钠包埋形成的小球速度快，分散快，成球强度高；聚乙烯醇包埋的成球性能不好，形成的固形物不分散；明胶包埋不能成球；海藻酸钠—明胶混合包埋可以成球，但小球聚合在一起不能分散开来，呈团状。

2.2 活菌数

淡紫拟青霉在固定化小球中的初始活菌数为4.0×107cfu·mL-1，于4 ℃保存7 d后，用平板法测得的活菌数为2.25×107cfu·mL-1，对照为0.01×107cfu·mL-1。可见，淡紫拟青霉经固定化后能显著提高存活能力。

2.3 包埋条件的优化

各处理对形成的淡紫拟青霉固定化小球的机械性能影响不大，各处理的初始活菌数为0.8×107cfu·g-1，对照为4.0×107cfu·g-1，存放7 d后的活菌数见表2。

比较各处理淡紫拟青霉的活菌数，最终得到优化后的包埋条件为：淡紫拟青霉含量25%、海藻酸钠含量4%、CaCl2含量12%、包埋时间2 h。

表1 包埋材料对淡紫拟青霉固定化小球性能的影响1)Table 1 Compare to different embing materials of the P.lilacinus with physics capability

1)-表示不能成球或形状不规则，无此项数据。

A.海藻酸钠; B.聚乙烯醇; C.明胶; D.海藻酸钠—明胶。图1 包埋材料对淡紫拟青霉包埋效果的影响Figure 1 Resuts of different embing materials on P.lilacinus

包埋时间/h活菌数×107 cfu·g-1淡紫拟青霉含量/%活菌数×107 cfu·g-1海藻酸钠含量/%活菌数×107 cfu·g-1CaCl2含量/%活菌数×107 cfu·g-1125±3.51020±0.81-83±0.8265±2.31535±1.2311±1.81030±1.8350±2.52045±4.3535±1.21250±0.3445±1.52570±2.3725±3.31440±1.6550±3.2307±0.2910±2.3163±1.8

1)数据为平均值±标准误；-表示不能形成固定化小球；CK的活菌数为0.02×107cfu·g-1。

2.4 淡紫拟青霉在固定化小球中的存活能力

从图2可见，淡紫拟青霉在固定化小球中能够很好地存活。保存30 d时，活菌数从最初的2.63×107cfu·g-1增加至22×107cfu·g-1，保存60 d时的活菌数依然有5.5×107cfu·g-1。而对照淡紫拟青霉发酵液中的活菌数一直下降，30 d时的活菌数仅为0.0002×107cfu·g-1，60 d时则无法分离到淡紫拟青霉菌。

图2 海藻酸钠固定化小球中淡紫拟青霉的存活动态Figure 2 Survival dynamics of P.lilacinus in the immobilized cells

3 讨论

将细胞固定化技术应用于农业领域的研究开始于20世纪80年代。熊春林等[5]采用海藻酸钠包埋各种根瘤菌，测定根瘤菌在载体上和土壤中的存活情况，结果显示，30 d内有效活菌数一直增加，但之后菌数下降。李超敏等[6]将根瘤菌与光合细菌混合包埋制备微生物肥料的结果表明，固定化包埋颗粒能提高菌剂的有效期，微生物也能缓慢地从颗粒内部释放出来，有利于根瘤菌对大豆根部的侵染结瘤，盆栽试验也验证了这一结果。王梅等[7]研究表明，经包埋的巨大芽孢杆菌的存活期比直接保存在菌液中的要长很多，而且包埋在颗粒中的菌量还有一个缓慢的增加过程。

在固定化细胞载体方面，国内外学者研究较多的是将细胞包埋在海藻酸钙、聚乙烯醇凝胶等作为载体形成的凝胶中加以固定[8]。在固定化条件的优化方面，鲁玉侠等[9]认为，1 h为海藻酸钠固定脂肪酸酶的最佳固定时间。吴定等[10]用海藻酸钠固定酵母菌的结果表明：用2.5%海藻酸钠包埋的成球性能、机械性能较好；用含量大于6%的海藻酸钠包埋，发酵产生酒精的能力下降。王克明[11]以海藻酸钠为载体包埋固定紫色红曲霉(Monascuspurpureus)发酵生产红曲色素，其最佳的发酵条件为：细胞接入量20%、海藻酸钠含量4%、CaCl2含量10%，此条件下的包埋效果较佳。

本试验对淡紫拟青霉的固定化方法进行研究的结果表明，用海藻酸钠包埋淡紫拟青霉的成球性能好，成球强度高。通过单因素试验得到海藻酸钠固定淡紫拟青霉的最佳条件，将为下一步开发应用提供良好基础。

[1] 王洁,孙珮石,孙学习.固定化微生物技术及其应用研究的进展[J].广州环境科学,2004,19(1):1-4.

[2] Yoav B. Aiginate beads synthetic inoculant carriers for slow release of bacteria that affect plant growth [J]. Applied and Environmental Microbiology, 1986,51(5):1089-1098.

[3] Jung G, Muglnier J, Diem H G, et al. Polymer entrapped rhizobium inoculant for legumes [J]. Plant and Soil, 1982, 65(5): 219-231.

[4] 史怀,刘波,苏明星,等.淡紫拟青霉胞外多糖的分离、纯化及结构分析[J].生物工程学报,2010,26(8):1080-1087.

[5] 熊春林,黄隆广,丁磊.根瘤菌新载体及其接种效果的研究[J].微生物学通报,1989，16(2):66-69.

[6] 李超敏,韩梅,张良,等.根瘤菌—光合细菌复合型生物肥料固定化包埋的初步研究[J].山东农业科学,2006(3):50-53.

[7] 王梅,刘兆辉,江丽华,等.巨大芽孢杆菌固定化包埋材料的初步研究[J].江西农业学报,2009,21(12):57-58,63.

[8] 吕晓猛,纪树兰.固定化细胞珠体的改性研究[J].北京工业大学学报,1997,23(1):87-90.

[9] 鲁玉侠,蔡妙颜,郭祀远,等.海藻酸钠包埋法制备固定化脂肪酶研究[J].现代食品科技,2007(1):29-32.

[10] 吴定,温吉华,姚明兰,等.固定化酵母菌和醋酸杆菌发酵食醋工艺研究[J].中国酿造,2005(1):20-23.

[11] 王克明.固定化红曲生物反应器发酵红曲色素的研究[J].菌物系统,2000,19(2):268-271.