王正岩 仇晓菲 李岩磊 苗亚静 栾雅静

小细胞肺癌细胞系H446肿瘤细胞球培养方法的优化*

王正岩 仇晓菲△李岩磊 苗亚静 栾雅静

目的：探讨优化体外培养小细胞肺癌细胞株H446肿瘤细胞球的方法。方法利用干细胞无血清培养技术，观察H446细胞在下述不同培养条件下肿瘤细胞球的生长情况，并接种于超低吸附及非超低吸附培养板，调整细胞密度至1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL和1×107/mL，采用针头吹打法和移液器吹打法将肿瘤细胞球制成单细胞悬液用以进一步传代。结果（1）超低吸附培养板第2天形成明显肿瘤细胞球，非超低吸附培养板第10天出现肿瘤细胞球。（2）1×106/mL组每个高倍视野下约有7个肿瘤细胞球，每个细胞球约由几十个甚至上百个细胞组成。（3）针头吹打法传代后肿瘤细胞球活性和增殖能力明显优于移液器吹打法。结论选择超低吸附培养板、1×106/mL密度接种和针头吹打法可有效分离肿瘤细胞球。

肺肿瘤 癌,小细胞 细胞系,肿瘤 培养基,无血清 体外研究 细胞培养技术

肿瘤干细胞具有不断自我更新和无限分化潜能，是肿瘤复发、转移及耐药的根源。肿瘤干细胞可在无血清培养条件下经表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)等多种细胞生长因子诱导形成悬浮生长的细胞团块，称为球体(spheres)[1]。目前有关小细胞肺癌体外干细胞培养的研究较少。体外肿瘤细胞球培养条件比较严格，每个环节都可能影响肿瘤细胞球的形成及增殖。本实验探索了小细胞肺癌干细胞球的培养技术，并选用不同培养板、不同接种密度和不同吹打方法进行优化比较，为研究小细胞肺癌干细胞生物学特征提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 人小细胞肺癌细胞系H446购自美国典型培养物保藏中心（ATCC），DMEM/F12（1∶1）培养基购自Gibco公司，RPMI-1640培养基购自天津润泰科技发展有限公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自HyClone公司,甲基纤维素（methyl cellulose，MC）购自Sigma公司，EGF和碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)购自PeproTech公司，B27购自Gibco公司,聚2-羟乙基甲基丙烯酸酯（poly 2-hydroxyethyl methacrylate，polyHEMA）购自Sigma公司，24孔板购自天津润泰科技发展有限公司。

1.2培养方法 （1）细胞培养：将H446细胞用RPMI-1640培养液培养，内含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/L，置37 ℃，5%CO2环境下培养，备用。（2）无血清培养：无血清培养基（serum-free medium，SFM）由不含血清的DMEM/F12培养基，并添加20 μg/L EGF、20 μg/L bFGF、2%B27及0.7%甲基纤维素组成。甲基纤维素用去离子水配成20 g/L浓度溶液，使用前用2倍的DMEM/F12培养液稀释制成0.7%甲基纤维素溶液。选取对数生长期的H446细胞，用PBS液清洗，胰酶消化，重悬于SFM中并将细胞调整至1×106/mL，接种于24孔板中培养。细胞培养过程中，早期采用分孔半量补液，即将24孔板中一孔肿瘤细胞悬液的半量体积分置于另一孔，再将两孔分别补足标准量培养基。当后期细胞球数量增多和体积变大时，低速（800 r/min）离心换液。

1.3实验方法 为有效获得大量肿瘤细胞球，本实验在以下3个方面进行进一步比较。（1）不同培养板实验：为了解不同培养板对肿瘤细胞球增殖情况的影响，设立超低吸附培养板组和非超低吸附培养板组，均按上述无血清培养方法进行培养并观察比较。其中，超低吸附培养板为常规24孔板用溶解在无水乙醇中的10 g/L poly HEMA溶液铺2次，在超净工作台中风干24 h备用。非超低吸附培养板即为未铺poly HE⁃MA的常规24孔板。（2）不同接种密度实验：为了解不同接种密度对肿瘤细胞球增殖情况的影响，设立1×104/mL、1×105/mL、1×106/mL及1×107/mL 4个接种密度组，均接种于超低吸附培养板内，按上述无血清培养方法进行培养并观察比较。（3）不同吹打方法实验：为比较不同吹打方法对肿瘤细胞球增殖情况的影响，分别用1 000 μL移液器吹打法和5号针头吹打法2种方法将细胞球吹打成单细胞悬液。再用上述无血清培养方法接种于超低吸附培养板内，接种3 d,待培养孔中悬浮的肿瘤细胞球形状规则、体积较大后，吸取含有细胞球的培养液，800 r/min离心3 min，弃上清，用移液器或带5号针头的无菌注射器重新吹打成单细胞悬液，按1∶2的比例传代。在以上3组实验中，均每天于倒置显微镜下观察肿瘤细胞球数量、大小和细胞折光度等指标，并进行肿瘤细胞球计数：每孔内随机取5个200倍视野分别计数，取其平均值记为此孔的肿瘤细胞球数量。

2 结果

2.1不同类型培养板对肿瘤细胞球形成及增殖的影响 采用超低吸附培养板，接种细胞24 h后，肿瘤细胞球形成，平均每个视野有8个细胞球，大小不一，每个细胞球所含细胞数达数十个至上百个，呈圆形、卵圆形或桑葚状，悬浮生长，折光性好，细胞之间连接紧密，见图1A；采用非超低吸附培养板，接种细胞48 h后大部分细胞贴壁呈梭形生长，少部分细胞呈悬浮状态生长，培养至第10天有肿瘤细胞球形成，平均每个视野有3个细胞球，每个细胞球约由10个细胞构成，见图1B。

2.2不同接种密度对肿瘤细胞球形成及增殖的影响 按1×104/mL和1×105/mL密度接种，第3天观察有肿瘤细胞球形成，数量较少，平均每个视野有3个球体，直径较小，大约由4～5个细胞组成，见图1C；按1×106/mL密度接种，第2天即有明显肿瘤细胞球形成，平均每个视野有7个球体，细胞球体积大小不一，每个球体所含细胞数有几十个甚至上百个，细胞球致密均一，折光性良好，呈悬浮生长，见图1D；按1×107/mL密度接种，第2天有细胞球形成，平均每个视野有5个球体，每个细胞球约由几十个细胞形成，细胞球悬浮生长，但贴壁分化生长细胞较多，且出现数个较大的连接松散的黏附细胞团。

2.3不同吹打方法对亚代肿瘤细胞球形成的影响 采用针头吹打法，细胞球能很好地分散开，形成单细胞和部分小细胞球。传代后第3天亚代肿瘤细胞球出现，平均每个视野有8个球体，每个细胞球约由40个细胞组成，细胞球折光性良好，连接紧密，以圆形居多，与原代细胞球无明显差别；采用移液器吹打法，细胞球不能很好地分散开，形成少部分单细胞和较多大细胞球，传代后第3天肿瘤细胞球折光性差，中央有细胞死亡，平均每个视野有4个细胞球，每个细胞球约由20个细胞组成。

3 讨论

目前关于肺癌肿瘤干细胞的无血清培养技术仍存在争议。长期研究发现，含EGF和bFGF的无血清培养基有利于正常干细胞体外扩增[2]。Eramo等[3]在含EGF和bFGF的无血清DMEM/F12培养基内富集了肺癌干细胞球。Levina等[4]将非小细胞肺癌细胞H460和A549细胞在含EGF、bFGF和胰岛素的0.8%甲基纤维素培养基内培养，获得了大量富含肿瘤干细胞的细胞球。Bertolini等[5]用含EGF、bFGF和B27的无血清培养基培养得到了肺癌干细胞球。本实验在无血清培养基内添加了EGF、bFGF和B27添加剂，并且有效地分离了肿瘤细胞球。考虑原因为EGF和bFGF促进了细胞有丝分裂和抑制细胞分化，B27作为血清替代物，既保留了细胞赖以生存的必需营养物质，如胰岛素和转铁蛋白，又去除了血清中的促分化剂。

恶性上皮肿瘤呈贴壁生长，一旦阻止其贴壁，癌细胞便迅速凋亡，这种细胞凋亡方式称为anoikis[6]。肿瘤干细胞具有anoikis抗性，在无血清培养条件下，经EGF和FGF等细胞生长因子诱导，干细胞可以形成悬浮生长的细胞球体。为了提高细胞球的形成率，本实验采用低黏附物质polyHEMA铺板制备超低吸附培养板。与非超低吸附培养板相比较，不仅肿瘤细胞球出现较早，而且细胞球数量多且体积大，考虑原因可能为超低吸附培养板促使分化的细胞因不能贴壁生长而加快了凋亡。本实验还采用半固体甲基纤维素培养基，进一步诱导细胞凋亡而有效促进了单细胞克隆球的形成。

肿瘤干细胞增殖所具备的条件包括细胞分裂模式、细胞周期、细胞信号和微环境。细胞自分泌或旁分泌的分泌因子和细胞间的相互作用是维持微环境的重要因素。本研究结果表明，1×106/mL的细胞接种密度是促进肿瘤细胞球增殖的最佳密度；1×104/mL和1×105/mL的接种密度中，细胞多保持单细胞状态，细胞增殖速度较慢，考虑原因可能是培养体系中肿瘤干细胞绝对数量小，能进行对称分裂增殖的细胞数量少，且细胞间自分泌和旁分泌所形成的分泌因子作用薄弱，致使细胞不能大量增殖；而1×107/mL接种密度下，出现大量细胞贴壁和细胞黏附成团现象，并且早期大量细胞死亡。以上结果提示，接种密度过大易使细胞重聚成团致中心细胞死亡，贴壁细胞的分化又进一步促进了重聚细胞团的分化，导致肿瘤干细胞成球效率并不能提高。在肿瘤细胞球培养的换液过程中，本实验早期采用分孔半量补液方法，待后期细胞球数量增多和体积变大时过渡到离心换液，既保留部分原来的微环境，又避免早期离心对细胞的损害，有效地增加了肿瘤细胞球的数量。在肿瘤细胞球培养的传代过程中，本实验采用针头吹打法效果优于移液器吹打法。由于细胞增殖形成的肿瘤细胞球结合非常紧密，用1 000 μL移液器吹打时不能将细胞球有效分散，导致中央细胞因营养渗透障碍而发生凋亡现象；使用针头吹打法，细胞球能较好地分散开，形成单细胞和少量小细胞球，其亚代克隆具有很强的增殖和传代能力，故传代时针头吹打法制备单细胞悬液是较好选择。但是在采用针头吹打法时应掌握好吹打力度及次数，尽量轻柔，避免产生气泡，不可无限增加吹打次数，吹打的次数保持5次左右较好，以形成大量单细胞和少量小细胞球的悬液即可。

综上，为有效获得肿瘤细胞球，使用甲基纤维素培养基和超低吸附培养板是必要的，1×106/mL是最佳接种密度，传代时制备单细胞悬液采用针头吹打法较好。

[1] Mimeault M,Hauke R，Mehta PP，et a1.Recent advances in cancer stem/progei-tor cell research:therapeutic implications for overcom⁃ing resistance to the most aggressive cancers[J].J Cell Mol Med,2007,11(5):981-1011．

[2] Martens DJ,Tropepe V,van der Kooy D.Proliferation kinetics of fi⁃broblast gro-wth factor-responsive and epidermal growth factor-re⁃sponsive neural stem cells within the embryonic forebrain germinal zone[J].J Neurosci,2000,20(3):1085-1095．

[3] Eramo A,Lotti F,Sette G,et al.Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population[J].Cell Death Differ,2008,15(3):504-514.

[4] Levina V,Marrangoni A,Wang T,et al．Elimination of human lung cancer stem cells through targeting of the stem cell fac⁃tor-c-kitautocrine signaling loop[J].CancerRes,2010,70(1):338-346．

[5] Bertolini G,Roz L,Perego P,et al．Highly tumorigenic lung cancer CD133+cells display stem-like features and are spared by cisplatin treatment[J].Proc Natl Acad Sci USA,2009,106(38):16281-16286.

[6] 耿沁，董强刚，姚明，等.肺癌干细胞的球体形成与致瘤性分析[J].肿瘤,2008,28(9):751-754．

Optimization of the Method to Culture Tumor Cell Spheres in Human Small Cell Lung Cancer Cell Line H446

WANG Zhengyan,QIU Xiaofei LI，Yanlei,MIAO Yajing，LUAN Yajing

Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China

Objective:To optimize the method to culture the tumor cell spheres in small cell lung cancer(SCLC)cell line H446 in vitro.Methods:Using the serum-free culture technology,the growth situation of the H446 tumor cell spheres was observed in different culture conditions.The cells were inoculated to ultra low adherent plates and non-ultra low adher⁃ent plates.The cell density was adjusted to 1 ×104/mL,1×105/mL,1×106/mL and 1×107/mL.The cell spheres were blown in⁃to single cells through micropipette blow method and pinhead blow method in order for further passages.Results:（1）In ultra low adherent plates,the tumor spheres appeared clearly at the second day,while in the tenth day in non-ultra low adherent plates.（2）At the concentration of 1×106/mL,there were about seven spheres per high power field and dozens of cells even hundreds of cells for each sphere.（3）In the pinhead blow method,the tumor spheres showed better activity and proliferative ability in second generation.Conclusion:The tumor spheres can be separated effectively by ultra low adherent plate,the in⁃oculum density of 1×106/mL and the pinhead blow method.

lung neoplasms carcinoma,small cell cell line,tumor culture media,serum-free in vitro cell cul⁃ture techniques

*天津市自然科学基金资助项目（项目编号：09JCZDJC20300）作者单位：300070 天津医科大学基础医学院病理教研室

△通讯作者 E-mail:qiouxf@tijmu.edu.cn

（2010-06-28收稿 2010-09-08修回）

（本文编辑 陆荣展）