李 鹏 尹雅玲 卢光洲 赵繁荣 梁金英

枸杞多糖抑制对硫磷致血管内皮功能损伤的研究*

李 鹏 尹雅玲△卢光洲 赵繁荣 梁金英

目的：探讨枸杞多糖（LBP）抑制对硫磷（DNTP）所致的血管内皮功能损伤的作用。方法DNHP与大鼠离体胸主动脉血管环（EVAPVR）和培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共孵30 min，以LBP为保护、以超氧化物歧化酶（SOD）为对照，检测血管内皮依赖性舒张反应（EDRR）、内皮细胞单层通透性（ECMP）及细胞培养液生化指标。结果血管环实验结果显示，LBP（10 g/L）明显减轻了DNTP（4.5 μmol/L）对血管EDRR的抑制作用；细胞实验结果显示，LBP（10 g/L）明显降低了ECMP，增加了细胞培养液中SOD和一氧化氮（NO）的含量、降低了丙二醛（MDA）的含量（均P<0.05），与SOD对照组的作用相当。结论LBP可抑制DNTP所致的血管内皮功能损伤，其机制可能与氧化应激有关。

枸杞△ 多糖类 对硫磷 主动脉,胸 内皮细胞 血管舒张 脐静脉 氧化性应激 大鼠,Sprague-Dawley

目前，对硫磷（DNTP）、辛硫磷、丙溴磷等有机磷（OPs）农药依然在我国农村地区大量使用。虽然大多数农民已经注意预防急性OPs中毒，但是长期低剂量接触的OPs农药对机体产生的损伤并未引起足够重视。本研究以大鼠离体胸主动脉血管环（EVAPVR）和培养的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为模型，观察枸杞多糖（LBP）抑制DNTP所致血管内皮功能损伤的作用，并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1材料 清洁级Sprague-Dawley大鼠，雄性，56只，35～50日龄，体质量180～220 g（河南省实验动物中心）；人脐静脉内皮细胞株（HVUECV-304）、LBP、胰蛋白酶、DMEM培养基、新生小牛血清、青霉素、链霉素（长沙力康生物有限公司）；DNTP（美国Sigma公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）试剂盒（南京建成生物公司）；其他试剂为国产分析纯；混合醋酸纤维滤膜（直径25 mm，孔径0.8 μm）、针头式滤器（外径25 mm、内径20 mm）购自上海医药工业研究院；RM6240B/C生物信号采集处理系统（成都仪器厂）；全自动定量绘图酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2实验设计与分组

1.2.1血管环实验 大鼠称质量，腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，切断双侧颈总动脉放血处死，开胸后快速取出胸主动脉置于4℃的K-H缓冲液中，并通以95%O2+5%CO2混合气体。分离并去除血管周围的脂肪及结缔组织，剪成3～4 mm长的血管环，将血管环移至含有K-H缓冲液（恒温37℃，通以95%O2+5%CO2混合气体）的浴槽，检测血管环内皮依赖性舒张功能。血管环实验分7组：（1）正常对照组。（2）LBP（10 g/L）对照组。（3）DNTP对照组。（4）低剂量LBP保护组，LBP（0.1 g/L）＋DNTP。（5）中剂量LBP保护组，LBP（1 g/L）＋DNTP。（6）高剂量LBP保护组，LBP（10 g/L）＋DNTP。（7）SOD对照组，SOD（200 U/L）＋DNTP。实验中每组8个血管环，7组共需56个血管环，分别来自56只Sprague-Dawley大鼠,DNTP均为4.5 μmol/L。

1.2.2细胞实验 HVUEC用0.25%胰蛋白酶进行消化，用含有15%新生小牛血清的DMEM培养基（青霉素，100 U/mL；链霉素，100 U/mL；pH 7.4）制成细胞悬液，接种于培养瓶内，置于5%CO2培养箱（37℃）中培养，每2天更换培养液1次。当内皮细胞生长至致密融合后，进行传代培养。取生长良好的第3代内皮细胞用消化液消化,弃消化液,加入培养液吹打制成细胞悬液,对悬液做细胞计数，超净台下，将内皮细胞接种于6孔细胞培养板内底面的滤膜上（接种密度约为2×105个/cm2），检测内皮细胞单层通透性。取细胞培养液检测培养液中SOD、MDA及NO含量。细胞实验分7组，分组及给药方法同血管环实验。实验中每组8个滤膜（滤膜上载有致密的内皮细胞单层），7组共需56个滤膜。

1.3血管环内皮依赖性舒张功能的检测 将处理好的离体胸主动脉血管环（EVAPVR）一端用不锈钢钩固定于浴槽内，另一端连张力换能器，将血管的收缩与舒张反应通过RM6240B/C生物信号采集处理系统进行记录。血管环与各组实验药物孵育30 min，记录血管环正常收缩反应和乙酰胆碱（ACh）引起的血管内皮依赖性舒张反应（EDRR）。

1.4内皮细胞单层通透性的测定 接种于滤膜的HUVEC继续生长8～10 d，待滤膜上形成致密的内皮细胞单层后，即可检测内皮细胞单层通透性(ECMP)。滤膜上加入实验药物，共孵30 min，然后滤膜用Hank’s缓冲溶液冲洗2次，置于针头式滤器内（有效滤过面积S=3.14 cm2）。针头式滤器上孔接长颈储液瓶（上腔），下孔接量筒（下腔）。上腔中加入5 g/L白蛋白液（液面距离滤膜高度维持在25 cm），蛋白液通过液体流动产生的牵引作用透过滤膜进入下腔。平衡5 min后，收集5～10 min滤出液，测量滤出液容积，计算滤出液生成速度Jv，内皮单层滤过系数Kf和渗透压反射系数σ。每组8个滤膜，将各组实验药物加到滤膜上与单层内皮细胞孵育30 min，然后检测Jv值、Kf值和σ值。

1.5细胞培养液中SOD、MDA及NO含量的测定 取不同实验组的细胞培养液100 μL，酶标法检测SOD、MDA及NO的含量。

1.6统计学处理 应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理。所有数据以均数±标准差表示。多组比较采用方差分析，组间比较采用SNK-q检验，检测水准为双侧α＝0.05。

2 结果

2.1LBP对EVAPVR的Emax和EC50的影响 高剂量LBP保护组、SOD对照组与DNTP对照组比较，ACh引起的Emax明显升高，ACh引起的EC50明显降低，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 LBP对EVAPVR的Emax和EC50的影响

表1 LBP对EVAPVR的Emax和EC50的影响

*P<0.05,表2、3同

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2.2LBP对ECMP的影响 高剂量LBP保护组、SOD对照组与DNTP对照组比较，Jv、Kf明显降低，σ值明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2LBP对ECMP的影响

表2LBP对ECMP的影响

组别 Jv(μL·min-1·cm-2)Kf(μL·min-1·cm-2·kPa-1)σ正常对照组（1）LBP对照组（2）DNTP对照组（3）低剂量LBP保护组（4）中剂量LBP保护组（5）高剂量LBP保护组（6）SOD对照组（7）F q（3）∶（4）（3）∶（5）（3）∶（6）（3）∶（7）27.34±0.55 28.43±1.98 38.88±0.78 36.74±0.76 29.59±0.64 27.40±0.76 26.86±0.78 30.47*2.51 2.96 4.59*4.51*12.03±0.46 12.11±0.60 19.86±0.54 19.74±0.23 16.23±0.13 12.06±0.39 12.79±0.66 28.21*2.67 3.34*4.54*4.32*0.61±0.03 0.60±0.02 0.27±0.03 0.28±0.02 0.44±0.05 0.53±0.02 0.59±0.02 27.66*2.59 3.45*4.49*4.52*

2.3LBP对HUVEC细胞培养液中各项生化指标的影响 高剂量LBP保护组、SOD对照组与DNTP对照组比较，细胞培养液中MDA含量降低，SOD含量和NO含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 LBP对HUVEC细胞培养液中生化指标的影响

表3 LBP对HUVEC细胞培养液中生化指标的影响

组别 MDA(μmol/L) SOD(kU/L) NO(μmol/L)正常对照组(1)LBP对照组(2)DNTP对照组(3)低剂量LBP保护组(4)中剂量LBP保护组(5)高剂量LBP保护组(6)SOD对照组(7)F q （3）∶（4）（3）∶（5）（3）∶（6）（3）∶（7）1.32±0.16 1.30±0.11 2.98±0.41 2.92±0.22 2.25±0.35 1.39±0.73 1.41±0.32 27.16*2.87 3.21 4.52*4.44*54.22±2.64 53.43±2.57 16.85±1.45 22.90±1.05 43.96±3.17 52.79±2.66 52.75±0.64 29.21*2.31 3.66*4.33*4.21*21.44±2.66 20.66±1.75 7.58±1.63 9.66±1.47 16.55±1.46 20.41±1.75 21.75±1.28 28.69*2.65 3.78*4.43*4.52*

3 讨论

Mackness等[1-2]的调查显示，长期在温室里喷洒OPs农药的花工或用OPs农药浸泡羊毛的牧民，其体内对硫磷酶-1（PON1）活性和水平明显降低；Fo⁃kina等[3]调查发现，长期接触过OPs农药的人有血压增高、脂代谢紊乱、血管张力降低和心、脑血管的动脉粥样硬化早期临床表现。笔者此前的研究发现，OPs农药（DNTP）明显损伤血管内皮细胞的功能，诱发多种血管性疾病（如动脉粥样硬化、糖尿病等）[4-5]。血管内皮功能的损伤是多种血管疾病（如动脉粥样硬化、糖尿病等）形成的起始因素，本研究通过体外血管环实验及细胞实验观察了DNTP对血管内皮功能的损伤作用以及LBP抑制DNTP的损伤作用。

Emax代表最大舒张百分率，Emax越大，内皮依赖性舒张功能越强；EC50代表半效应浓度，EC50越大，内皮依赖性舒张功能越差。本研究发现，LBP（10 g/L）明显抑制了DNTP（4.5 μmol/L）引起的内皮依赖性舒张功能下降。Jv、Kf和σ值是反映ECMP的指标。Jv表示单位时间内从单位面积内皮细胞单层上滤出的液体量，可间接反映内皮细胞单层通透性，Jv值越大，通透性越高；Kf是内皮细胞单层通透性的参数，直接反映内皮细胞单层通透性，Kf值越大，通透性越高；σ值指渗透压反射系数，反映的是内皮单层对大分子物质的通透性，σ值越小，通透性越高。本研究显示，LBP（10 g/L）明显抑制了DNTP（4.5 μmol/L）所致的ECMP的升高。MDA、SOD、NO是检测细胞培养液中氧化还原指标的常用参数。本研究表明，LBP（10 g/L）明显抑制了DNTP（4.5 μmol/L）引起的细胞培养液中氧化性指标上升，提示LBP抑制DNTP对内皮功能的损伤与触发“氧化应激”反应有关，但其确切的机制有待进一步研究。

枸杞是我国传统中药材，《本草纲目》中记载枸杞具有“补精气诸不足，明目安神，令人长寿”的功效。现在药理学研究证明，枸杞具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血脂、降血糖等作用[6-8]。经红外光谱推测LBP可能含-OH、-COOH、-NH2-或-NH-基团。通过理化性质分析，证明LBP中不含蛋白质、淀粉和还原糖的酸性多糖。本实验证明了LBP有明显的抗氧化作用，可以有效抑制由OPs引起的对机体的慢性损伤。

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Study of Inhibitory Effect of Lycium Barbarum Polysaccharide on Damnification of Blood Vessel Endothelium Function Induced by DNTP

LI Peng,YIN Yaling,LU Guangzhou,ZHAO Fanrong,LIANG Jinying

Pharmacy College,Xin xiang Medical University,Henan 453003,China

Objective:To explore the mechanism of inhibitory effect of lycium barbarum polysaccharide(LBP)on dam⁃nification of blood vessel endothelium function induced by parathion(DNTP).Methods:The isolated rat thoracic aortic rings(EVAPOR)and cultured human umbilical vein endothelial cells(HUVEC)were incubated with DNTP for 30 min.LBP was used for protective effect and the level of superoxide dismutase(SOD)was used as the control.The endothelial-dependent re⁃laxation reaction(EDRR),endothelial cell monolayer permeability(ECMP)and biochemical index were detected.Results:The result of the vascular circle experiment showed that LBP(10 g/L)obviously reduced the inhibitory effect of DNTP(4.5 μmol/L)on vascular EDRR.The result of cell experiment showed that LBP(10 g/L)obviously reduced the ECMP and MDA,and increased the level of SOD and nitric oxide(P<0.05,respectively).These effects were corresponded with the SOD con⁃trol.Conclusion:LBP inhibited the damnifivation of blood vessel endothelium function induced by DNHP,which may be re⁃lated to the oxidative stress.

LYCIUM BARBARUM polysaccharides parathion aorta,thoracic endothelial cells vasodilation umbilical veins oxidative stress rats,Sprague-Dawley

*河南省教育厅2010年度自然科学研究计划项目（项目编号：2010B330002）；河南省重点学科开放性课题（课题编号：ZD200906）

453003 新乡医学院药学院（李鹏，卢光洲，赵繁荣，梁金英），基础医学院（尹雅玲）

△通讯作者 E-mail：hnpdsyyl@163.com

(2010-05-18收稿 2010-09-06修回)

（本文编辑 李国琪）