西安交通大学医学院第一附属医院麻醉科(西安 710061) 盖毅文 来炳祺 成少利 郭 雄

异氟烷对大鼠肝缺血再灌注肺组织损伤的保护作用研究△

西安交通大学医学院第一附属医院麻醉科(西安 710061) 盖毅文 来炳祺*成少利#郭 雄#

目的:探讨异氟烷对大鼠肝缺血再灌注后肺损伤的保护作用。方法:将20只SD大鼠随机分为两组,每组10只。两组均用氯胺酮(1m g/kg)基础麻醉。对照组进行假手术,吸入组应用异氟烷持续吸入维持麻醉后进行手术,肝脏缺血再灌注后取肺脏灌洗液以及肺组织标本。测定NF-κB的含量以及肺组织形态学观察。结果:异氟烷对实验动物维持麻醉,可以有效地降低肺组织以及肺泡灌洗液中NF-κB的含量,肺组织损伤性变化减轻。结论:异氟烷对大鼠肝缺血再灌注肺组织损伤具有明显的保护作用。

随着免疫抑制剂的开发应用及器官移植外科技术的发展,移植器官成功率得到很大的提高。急性排斥反应已被很好控制,所以器官移植后移植物功能恢复,病人存活质量以及并发症的发生问题也随之受到越来越多的关注。其中肺部并发症问题成为焦点。当移植肝复流肺后,组织出现明显的病理改变[1],成为患者术后尽早康复的主要障碍之一,甚至成为病人死亡的主要原因之一。其发生原因可能有二:①肺脏和外界相通;②移植后免疫抑制剂的大量应用使机体处于低免疫状态,肺部继发感染的情况极易发生。再加之终末期肝硬化病人其本身肝性肺损害的存在,肺脏本身的基础性病变也使肺脏成为肝移植术后多种损伤因子的作用攻击的重点靶器官。肝缺血再灌注后释放的自由基和炎性因子经血液循环直接到达肺循环聚集,活化肺巨噬细胞和聚集白细胞,继发地再次释放更多的自由基和炎性因子,使肺血管床通透性进一步增高,血管通透性提高,使组织和细胞水肿、损伤,进而出现肺水肿和损害肺功能,情况继续发展可发生急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。防止肝移植后肺部并发症须从手术阶段开始,除了严格限制术中液体输入量外,麻醉药的选择也至关重要。近年的研究发现一些全麻药对器官缺血再灌注损伤具有保护作用,也有人发现丙泊酚能减轻肢体和肠缺血再灌注对肺的损伤作用。全麻药是否对肝缺血再灌注后的肺损伤是否也具有保护作用,尚未见有报道。本研究探讨异氟烷对大鼠肝缺血再灌注后肺组织损伤保护作用。

材料与方法

1 动物分组以及模型复制 将 20只 SD大鼠随机分为两组,每组10只。两组均在同样环境下喂养3d,手术前用氯胺酮基础全身麻醉。对照组进行直接手术。吸入组加用异氟烷(4mg/(kg· h))吸入维持麻醉同时进行手术:麻醉后在左颈外静脉置管供术中补液,分离气管并做气管插管,呼吸机辅助呼吸。用股动脉置管供循环监测。腹正中切口,游离肝门,用小号无损动脉夹阻断头侧三叶的门静脉和肝动脉分支,保持尾三叶开放,90min后开放120min后处死动物。用生理盐水进行双肺肺泡灌洗,灌洗液以 2500r/m离心 15min后测定备用;取新鲜肺组织标本一块,在液氮中固定保存备用;取新鲜肺组织标本一块 4%甲醛溶液中固定保存备用。

2 实验试剂 异氟烷,氯胺酮,生理盐水,4%甲醛固定液,NF-κB免疫组化试剂盒。

3 测定方法 用免疫印迹法(Western-Blot)进行测定NF-κB,并用图像分析方法进行定量。肺组织组织行 HE染色在显微镜下观察。

结 果

1 镜下组织形态学变化 见图 1～2。对照组,肺泡间质及肺泡腔内大量巨噬细胞,少量中性粒细胞,肺间质疏松化,水肿。吸入组可见肺泡内巨噬细胞,中性粒细胞明显减少,肺泡、肺间质结构基本正常。

图 1 对照组形态学变化(HE 10×40)

图2 吸入组形态学变化(HE 10×40)

2 Westren-Blot检测 NF-κB结果 见图 3。应用异氟烷对实验动物维持麻醉,可以有效地降低肺组织以及肺泡灌洗液中 NF-κB的含量(P＜0.01)。

图 3 不同分组大鼠肺组织 NF-κB的 W estern-Blot比较

讨 论

本组结果显示,肝脏缺血再灌注后肺组织中 NF-κB表达明显增加,增加的 NF-κB按其机制必然导致肺脏有明显的损伤,这与本研究的切片所见一致。异氟烷可以明显抑制肺组织内以及肺泡灌洗液中的 NF-κB的含量,从而抑制由于缺血再灌注而引发的不需要而被增加NF-κB给肺组织带来的一系列伤害;本组光镜下观察肝脏缺血再灌注肺损伤明显,主要表现为肺间质,肺泡炎性细胞(巨噬细胞,中性粒细胞)明显增多,肺间质水肿,疏松化,而在应用吸入异氟烷维持麻醉后,肺泡内巨噬细胞明显减少,肺泡、肺间质的病变也明显减轻,从而使得其引发的对肺脏的损伤减轻。

缺血-再灌注损伤是常见的病理生理过程,越来越受到重视和研究。肝脏移植的发展使有关肝脏缺血-再灌注的后肺损伤研究成为热点。肝脏缺血-再灌注损伤的发生原因是复杂多样的:缺血导致一系列细胞结构改变,能量代谢障碍,功能障碍;复流后,中性粒细胞,巨噬细胞等被激活而产生并释放大量自由基和一些促炎症细胞因子,如 NF-κB、TNF-α等,造成组织损伤和血管通透性增加;以及自由基直接损伤作用等,从而引起全身炎症反应,表现为对全身多个靶器官的损伤,而肺部的损伤是其中比较常见的病理变化之一。

NF-κB是一种多极性的具有基因转录调控作用的蛋白质因子,在未受刺激时,细胞质中 NF-κB与抑制蛋白 I-κB结合处于非活化状态,但是当各种原因的刺激时 I-κB被降解,与 NF-κB发生解离 ,解离后 NF-κB进入细胞核与特异的启动子结合(NF-κB也只有进入细胞核才能发挥其作用),调节基因表达。NF-κB调节许免疫和炎症介质的基因转录和表达,缺血再灌注损伤的细胞因子、黏附分子的基因转录也受到NF-κB的控制,它们的生物合成也便被制约。直接或间接地参与缺血再灌注(IIR)损伤的控制。Haseoun等发现缺血再灌后 NF-κB的活性显著性升高,因此必然导致相关组织器官的损伤。姜 琳等[2]研究发现异氟烷预处理使大鼠心肌梗死面积减少,对心肌缺血再灌注损伤有一定的保护作用。NF-κB特异性抑制剂小白菊内脂(Parthenolide,PTN)可阻断此作用,推测NF-κB可能介导了异氟烷预处理的心肌保护作用。Alessandra R等[3]研究揭示NF-κB的抑制剂CAPE,可以明显保护小鼠骨骼肌缺血再灌引起损伤。这也说明NF-κB介导了缺血再灌的损伤。Zou等也发现IIR通过NF-κB依赖性机制诱导细胞间黏附分子-1表达,可直接引起血管内皮细胞和肠上皮细胞损伤,NF-κB的活化如果被抑制抑制,肠黏膜的损伤程度可明显减轻。证实了缺血再灌注后 NF-κB的表达增加,同时可以观察到肠膜损伤加重,提示 NF-κB激活后通过调控细胞因子和黏附分子等蛋白的表达而参与再灌注损伤的发生过程。在缺血再灌导致NF-κB的不适当(往往是过当)激活是引起过度炎症反应及炎症损伤的关键因素,从可加重不需要急性炎症反应。NF-κB的激活可增强 TNF-α,白细胞介素-1的转录,TNF-α,白细胞介素-1水平的升高可进一步增高NF-κB的激活,如此恶性循环,炎症反应被进一步放大而招致组织器官损伤加重[4～6]。

多数全身麻醉药有抑制中性粒细胞,巨噬细胞等免疫细胞活性,减低免疫反应强度,在一定程度上,使机体的免疫力降低,不利于疾病清除;但是从另一个角度来看,在严重创伤、脓毒症、缺血再灌损伤等病理条件下,中性粒细胞过度激活,可衍变成全身不需要的炎性反应综合征,全麻药的这种抑制作用便是对于机体确实十分有利的。

总之,NF-KB可调控与炎症和免疫反应有关的许多炎症介质基因的表达,麻醉剂可以抑制各种炎症反应。由于ARDS是临床治疗过程比较棘手的问题。而其病理变化主要是缺血再灌注后引发的一系列炎症反应所致。本研究应用丙泊酚对实验动物维持麻醉,可以有效地降低肺组织以及肺泡灌洗液中 NF-κB的含量,从而抑制由NF-κB启动的一系列炎性因子参与的,对人体造成严重伤害反应。因此丙泊酚用于临床麻醉可以有效地降低此 ARDS发病率以及病死率,具有一定的临床价值。但是炎性细胞因子过量产生及NF-κB活化在 ARDS发病过程中的作用及机制仍需进一步明确。

[1] Co lletti LM,Burtch GD,Rem ick DG,et a l. The p roduction o f tumor necrosis factor and the development of a pulmonary capillary injury following hepatic is chem ic/reperfusion [J].Transp lantation,1990,49(2):68-72.

[2] 姜 琳,王 琛,覃 琴,等.异氟烷预处理对心肌缺血再灌注损伤的保作用 [J].复旦大学学报(医学版),2008,35(4):539-542.

[3] Alessand ra R,Andrade S,Fernando S,et a l.Effect of N F-κB inhibition by CAPEon skeletalmuscle ischem iareperfusion injury[J].Journal of Surgical Research,2009,153(2):254-262.

[4] W ang QY,Guo P,Duan LL,et a l.Alpha-1,3-fucocslt transferase-V II stimulates the grow th of hepatocarcinoma cells via the cyclin-dependent kinase inhibitor p27(Kip1)[J].Cell Mol Life Sci,2005,62(2):171-178.

[5] Baeuerle PA,Henkel T.Function and activity o f NF-κB the immune systems[J].Ammu Rev Immunol,1994,12(3):141-147.

[6] Grimm S,Baeuerle PA.The indueible transerip tion factor N F-kappa B:structure-function relationship of its p rotein subunits[J].Bioehem J,1993,290(p t6)2:297-308.

Protective effects of Isoflurane on lung injury from hepatic ischem ia-reper fusion in rats

Departm ent of Anesthesiology,the First Affiliated Hospitalof Medical
College,Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061) Gai Yiwen Lai binqi Cheng Shao li et al

Ob jective:To study the p rotective effects o f Isoflurane on lung in jury from hepatic ischem ia-reperfusion in rats.Methods:20 rats w ere random ly divided into tw o groups with 10 rats each group.The tw o groups w ere performed basic anesthesia with ketam ine(1mg/kg).sham surgery for control group,while experimenta l group w ere inha lationally anesthetized with Isoflurane tomaintain anesthesia during surgery in the same time.In two groups after hepatic ischem ia-reperfusion,lung lavage fluid and lung tissue w ere sampled.Observed morphological changes o f the lung tissues and determ ined N F-κB in lung tissue and lavage fluid.Resu lts:Isoflurane anesthesia during hepatic ischem ia-reperfusion in rats was effective in reducing N F-κB in lung tissue and lavage fluid,and lung tissue damage became attenuated.Conclusion:Isoflurane was effec tive to lung injury from hepatic ischem ia-reperfusion in rats.

Repefusion injury/drug effective Oxygen compound/therapeutic use Ketamine/therapeutic use Models,animal Rats

再灌注损伤 /药物作用 氧化合物 /治疗应用 氯胺酮/治疗应用 模型,动物 大鼠

R614.2

A

1000-7377(2011)01-0015-03

△陕西省社发攻关基金资助(No 2006K 12-G5(3))

* 陕西省肿瘤医院麻醉科

# 西安交通大医学院

(收稿:2010-07-03)