郭春龙 朱晓敏 曲世静 姜华茂

1962年,在紫杉属的植物提取物中，发现具有抗白血病和其它一些肿瘤的作用。1971年鉴定了这种提取物中具有抗癌活性的成分是紫杉醇(Paclitaxel,taxol)后，其研究日渐深入。一般认为紫杉醇作用的靶位点主要是微管蛋白/微管系统，促进微管聚合，抑制微管降解，使细胞分裂周期阻滞在G2/M期，最终导致细胞凋亡[1～3]。

近年来，国内、外已有报道紫杉醇诱导肺癌、食管癌、乳腺癌、白血病[4,5]细胞凋亡，但有关紫杉醇诱导膀胱癌细胞凋亡的报道目前尚少。本研究以人膀胱癌EJ细胞株为靶细胞，观察在不同浓度的紫杉醇作用后，细胞凋亡和bcl-2基因表达的改变，探讨其可能作用机制，为紫杉醇用于膀胱癌的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人膀胱癌EJ细胞株购自上海午立生物有限公司；紫杉醇注射液(规格：30 mg/5 ml，批号2004100211ED)购自上海华联制药有限公司； 100 bp DNA leader购自美国promega公司。

1.2 仪器设备

流式细胞仪(美国B.D公司)；荧光显微镜(Olympus，日本)；酶联免疫检测仪(DG3022A型，中国)；细胞图像分析仪(CIAS—1000型，中国)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 对照组：不加入紫杉醇，每天更换RPMI-1640培养液。实验组：紫杉醇浓度分别为1、10、100、1 000 nmol/L。接种细胞24 h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。

1.3.2 流式细胞仪检测 采用PI单染法[6],对实验细胞进行流式细胞仪上样分析，激发波长488 nm红色荧光，测定各期细胞DNA含量及细胞凋亡率。

1.3.3 bcl-2原位杂交检测 取对数生长期的膀胱癌EJ单细胞悬液5×105个,接种于含有载玻片的底面积为8 cm2的培养皿中。24 h后更换培养液，并加处理因素，培养48 h。用0.1MPBS(pH7.4)洗2 min×3次。针对人bcl-2靶基因进行原位杂交试验，倒置显微镜下观察结果并拍照，于细胞图像分析仪下进行统计分析。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 流式细胞仪检测结果

不同浓度的紫杉醇作用24、48 h后，对EJ细胞作用结果见表1、图1、图2。

表1 紫杉醇作用后EJ细胞的凋亡情况(n=5,±s，％)

表1 紫杉醇作用后EJ细胞的凋亡情况(n=5,±s，％)

组别凋亡率24h48h对照组2．15±0．392．37±0．40紫杉醇1nmol/L2．78±0．452．88±0．49紫杉醇10nmol/L4．88±0．89∗∗6．43±0．57∗∗△紫杉醇100nmol/L10．22±1．23∗∗15．36±1．33∗∗△△紫杉醇1000nmol/L18．11±1．59∗∗28．08±1．39∗∗△△

注：与对照组比较，*为P<0.05，**为P<0.01；与作用24 h比较，△为P<0.05，△△为P<0.01

由表1可见，紫杉醇浓度为1 nmol/L时，与对照组比较细胞凋亡率无显著性差异，随作用时间延长细胞凋亡率也无显著性差异。紫杉醇浓度>10 nmol/L以上时,与对照组比较,细胞凋亡率有显著性差异，且随作用时间的延长，细胞凋亡率也明显增高。

图1 不同浓度紫杉醇作用24 h时的流式细胞仪结果

图2 100 nmol/L紫杉醇不同作用时间的流式细胞仪结果

流式细胞仪检测DNA图上出现低于G1期DNA含量的亚二倍体峰，为细胞凋亡峰，峰下面积即为细胞凋亡率，图1A为对照组的流式细胞仪检测结果，可见未加紫杉醇的EJ细胞也有少量细胞发生凋亡，由图1中可以看出正常生长状态下的EJ细胞大多数处于G1期，S期次之，G2/M期最少。紫杉醇>10 nmol/L以上组细胞周期阻滞于G2/M期，随着紫杉醇浓度的增加，G2/M峰逐渐增高，另外，G1期前出现多个因坏死所致低平小峰，且低平小峰随紫杉醇作用时间延长而增多增高，但无论作用时间如何延长都不会出现凋亡峰。图1显示，紫杉醇作用时间相同的情况下，细胞凋亡峰随紫杉醇浓度的增大而增高。图2为紫杉醇浓度为100 nmol/L时分别作用24 h和48 h，细胞凋亡峰均较高，说明紫杉醇浓度为100 nmol/L时能明显诱导EJ细胞凋亡，且由图可直观看出48 h的凋亡峰要高于24 h，说明紫杉醇诱导细胞凋亡具有时间依赖性。

2.2 bcl-2原位杂交检测结果

bcl-2基因表达于细胞胞质中，呈棕黄色，紫杉醇作用后EJ细胞体积缩小，胞质着色变浅，bcl-2基因在胞质中的表达明显减弱。

应用细胞图像分析仪，在每个浓度组随机选取15个细胞，在每个高倍视野(×400倍)下测细胞的面积、圆形度和细胞胞质的灰度，见表2。

表2 紫杉醇作用下EJ细胞及Bcl-2基因表达的改变

注：与对照组比较 *为P<0.05，**为P<0.01

从表2中可以看出紫杉醇作用后，EJ细胞的面积缩小、圆形度增加、细胞变圆。紫杉醇作用后胞质中bcl-2基因表达也降低，说明紫杉醇可抑制bcl-2基因表达。

3 讨论

流式细胞仪检测DNA图上出现低于G1期DNA含量的亚二倍体峰为细胞凋亡峰，峰下的面积即为细胞凋亡率。图1A为对照组的流式细胞仪检测结果，可知未加紫杉醇的EJ细胞也有少量发生凋亡。而紫杉醇浓度为100 nmol/L和1 000 nmol/L组凋亡率明显增高，统计结果表明与对照组相比具有极显著性差异。

本研究，流式细胞仪结合透射电镜、琼脂糖凝胶电泳结果[7]，能够清楚看到紫杉醇有明显诱导EJ细胞凋亡的作用。这与Frank等[8]的研究结果相一致。他们运用Annexin及PI复染法检测凋亡，来区分早期凋亡、晚期凋亡和死亡，发现紫杉醇在较低浓度时便能诱导细胞凋亡。

流式细胞仪检测结果可见，紫杉醇10 nmol/L以上组与对照组比较有非常显著性差异，且随紫杉醇浓度的增大细胞凋亡率也明显增高。在10 nmol/L以上组，同一浓度下不同的作用时间细胞凋亡率也存在显著性差异，作用时间长细胞凋亡率就高。可见紫杉醇诱导EJ细胞凋亡具有明显的时间-剂量依赖性。赵世义等[9]在紫杉醇诱导肝癌细胞中也得出了同样结论。我们同时观察到药物浓度加大后(>1 000 nmol/L)坏死细胞逐渐增多。因此，我们认为从凋亡角度看诱导膀胱癌细胞凋亡应选择合适的药物浓度和作用时间，这样既可以启动膀胱癌细胞的“自杀”程序，又可使正常细胞避免因药物过大剂量和超长作用时间带来的损害，任意提高药物浓度及延长作用时间对诱导膀胱癌细胞凋亡是无益的。

bcl-2原位杂交检测结果显示紫杉醇作用后，bcl-2在胞质中的表达明显降低。细胞图像分析仪统计结果也表明bcl-2的表达随紫杉醇浓度的增大而降低，紫杉醇可抑制bcl-2基因的表达。bcl-2基因(即B细胞淋巴瘤/白血病-2基因)是1种原癌基因[10]。研究表明，bcl-2能够抑制细胞的凋亡而促进细胞的生长，但是这种抑制机制目前仍不清楚[11]。研究发现紫杉醇诱导的细胞凋亡往往伴随着bcl-2的磷酸化[12]。Haldar等[13]将白血病细胞用磷酸酶抑制剂处理后使bcl-2磷酸化，从而使细胞死亡，发现紫杉醇能诱导前列腺癌细胞的bcl-2磷酸化及细胞凋亡，不能诱导bcl-2缺陷株的凋亡。bcl-2能与bax形成异缘二聚体导致细胞凋亡，但bax的含量并没有因紫杉醇的处理而发生变化，推测稳定微管和bcl-2磷酸化可能是紫杉醇和同一靶位点相作用的结果，也许是通过刺激丝氨酸蛋白激酶途径[14]。Haldar等认为丝氨酸-70是紫杉醇诱导bcl-2磷酸化的一个重要作用位点，因为该位点被丙氨酸取代后，bcl-2的磷酸化被显著抑制[15]。最近又有学者发现，Bcl-2上的一段60个氨基的环状结构是bcl-2对抗紫杉醇诱导细胞凋亡的重要区域，因为bcl-2的磷酸化位点存在于该环中[16]。我们研究发现，bcl-2在膀胱癌EJ细胞中具有明显的表达，紫杉醇可抑制bcl-2的表达，其诱导bcl-2的磷酸化可能为EJ细胞凋亡的作用机制之一。

紫杉醇被誉为近15年来发现的最主要的抗癌药物，预测在今后10～15年内是抗癌的主要药品之一[17]。我们的试验表明紫杉醇通过抑制bcl-2基因的表达，具有明显诱导膀胱癌EJ细胞凋亡的作用。紫杉醇用于膀胱癌的治疗临床上还处于试验阶段，如何选择最佳的用药剂量，减少紫杉醇化疗的不良反应以及紫杉醇诱导膀胱癌细胞凋亡的机制还有待于进一步研究，相信紫杉醇将会成为治疗膀胱癌非常有价值的1种药物。

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