陶千山,罗 欣,柴 瑜,胡道军,张胜权

(安徽医科大学 生物化学与分子生物学教研室,安徽 合肥 230032)

人白介素-15基因系列启动子克隆及其荧光素酶报告基因载体的构建

陶千山,罗 欣,柴 瑜,胡道军,张胜权

(安徽医科大学 生物化学与分子生物学教研室,安徽 合肥 230032)

目的 克隆人白介素-15(IL-15)基因系列启动子,构建 IL-15基因启动子荧光素酶报告基因载体。方法通过 PCR方法从 HaCaT细胞基因组DNA中获得 IL-15基因编码序列 5′上游七段逐步缺失的 IL-15启动子序列;双酶切后,分别重组到含萤火虫荧光素酶的报告基因 p GL3-Basic载体上,构建 IL-15基因系列启动子报告基因载体;用脂质体转染法将含最长启动子序列的报告基因载体转染至 HaCaT细胞,并设置空白对照组和 LPS组分别处理;24 h后采用双荧光素酶报告基因系统检测其启动子活性。结果 经 PCR方法扩增出七段逐步缺失的 IL-15基因启动子片段,PCR及双酶切鉴定各重组体构建正确;瞬时转染 HaCaT细胞后经报告基因检测得知所克隆最长序列具有启动子活性。结论 成功构建了 IL-15系列启动子报告基因载体,并在 HaCaT细胞中初步活性分析得知所克隆IL-15基因调控系列内包含启动子核心区域,为进一步研究 IL-15表达调控机制奠定了实验基础。

IL-15;启动子;双荧光素酶报告基因

人白介素-15(IL-15)是一种重要的可溶性细胞因子[1]。其基因位于 4q31,跨度约 34 kb,含 9个外显子;成熟的 IL-15是一种糖蛋白,共 114个氨基酸残基组成,为一种四α-螺旋束结构,含两个二硫键及 C末端两个糖基化位点[2]。多种细胞和组织均可表达 IL-15,其中表达最高的是外周血单核细胞(PBMC)。IL-15表达异常与一些免疫性疾病的发生发展密切相关[2]。

IL-15基因表达调控机制复杂,其在多个表达水平受到多种因素的影响。目前的研究较集中于 IL-15基因表达的转录水平和翻译前水平,对于 IL-15基因上游调控序列的研究涉猎不多。为深入分析IL-15基因启动子的核心区域以进一步明确其调控机制,我们克隆了 IL-15基因逐步缺失的系列启动子,构建到报告基因载体 p GL3-Basic上并对其在人角质形成细胞株 (HaCaT细胞)中的活性进行了初步检测。

1 材 料

p GL3-Basic质粒、phRL-CMV质粒、Dual luciferase reporter Kit、质粒小量提取试剂盒,Promega公司;DMEM培养基和胎牛血清,GIBCO公司;Lipofectamine 2000,Invitrogen公司;细胞基因组提取试剂盒和凝胶回收试剂盒,Axygen公司;限制性内切酶 KpnⅠ和 XhoⅠ,大连宝生物工程公司;Ex Taq DNA聚合酶和 T4 DNA连接酶,Takara公司;ModulusTM多功能光度计,Turner BioSystems公司;HaCaT细胞和 E.coli JM 109菌株,本室冻存。

2 方 法

2.1 IL-15基因系列启动子的克隆

2.1.1 引物设计 从 http://genome.ucsc.edu/数据库检索获得 IL-15启动子序列,用 Primer Premier5.0分别设计七对启动子引物序列 (见表 1),并在上游引物 5′端加入 KpnⅠ的酶切位点 CGGGGTACC,在下游引物 5′端加入 XhoⅠ的酶切位点CCGCTCGAG。

表 1 PCR引物序列表Tab.1 PCR primers′sequence table

2.1.2 细胞培养及基因组提取 HaCaT细胞复苏后用含 10%胎牛血清的DMEM培养基在 37℃,5%CO2的孵箱中培养。培养至细胞状态良好时收集对数生长期细胞,以细胞基因组 DNA提取试剂盒提取其基因组 DNA。

2.1.3 启动子的克隆 以 HaCaT细胞基因组 DNA为模板 ,分别用 F0、F1、F2、F3、F4、F5、F6为上游引物、R为共同下游引物,经 94℃变性 50 s,55℃退火50 s,72℃延伸 1～3 min不等,共 32个循环,PCR扩增获得七段系列 IL-15基因启动子片段。然后用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,再切下凝胶上的目的条带用试剂盒回收纯化。

2.2 IL-15系列启动子报告基因载体的构建与鉴定

将上述克隆的系列启动子分别经 KpnⅠ和 XhoⅠ双酶切、回收,同时将荧光素酶报告基因 p GL3-Basic载体也进行 KpnⅠ和 XhoⅠ双酶切、回收。然后将各系列启动子分别与 p GL3-Basic载体在 T4连接酶的作下于 16℃连接 12 h,再以低温 CaCl2法将连接产物转化入 E.coli JM 109,涂布于含 100 mg/L氨苄青霉素的固体LB培养皿上过夜培养。挑取单克隆菌落培养后经 99℃、5 min热裂解,取上清做PCR鉴定阳性克隆,并以质粒小量提取试剂盒提取质粒进行 KpnⅠ和 XhoⅠ双酶切鉴定。

2.3 IL-15基因启动子报告基因载体转染 HaCaT细胞与活性检测

将含最长序列 (2 086 bp)启动子的重组质粒p GL3-Basic-IL-15PromoterF0、阴性对照 p GL3-Basic载体和内参照 phRL-CMV载体经紫外分光光度仪测定在 260 nm波长处的吸光度值进行定量。转染前 1天将 HaCaT细胞以 1×105/孔密度接种于 24孔板,第 2天当细胞约 90%融合时,每孔先加入无血清无双抗 DMEM 400μL,再分别定量加入含p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重组质粒 (或空载体p GL3-Basic,作为对照组)0.8μg,phRL-CMV内参照载体 80 ng和 Lipofectamine 2000 2μL的无血清无双抗 DMEM混合液 100μL,每组各计 6孔,并设两组复孔,置 37℃,5%CO2的孵箱中培养。6 h后弃培养液,换成全培养基,并将空载体对照组和重组载体两组再各分为两组,其中一组设置为空白对照组,另一组用 100 ng/mL脂多糖 (LPS)处理。18 h后弃培养液,磷酸盐缓冲液洗一遍,以被动裂解液 (PLB)在室温下轻晃 15 min裂解细胞,再取裂解液 20μL加底物荧光素 (LARⅡ)100μL在ModulusTM多功能光度计上测定萤火虫荧光素酶活性,后加入终止液 100μL检测海肾荧光素酶活性,计算两种荧光素酶活性的比值,并以空载体 p GL3-Basic比值作对照,分析启动子活性。

3 结 果

3.1 IL-15基因系列启动子的克隆

以 HaCaT细胞基因组 DNA为模板,克隆出七段 IL-15基因系列启动子,分别命名为 F0 2 086 bp;F1 1 841 bp;F2 1 586 bp;F3 1 236 bp;F4 1 084 bp;F5 827 bp;F6 548 bp(图1)。

图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 PCR agarose gel electrophoresis

3.2 IL-15启动子报告基因载体的 PCR鉴定

如图 2所示,从挑选的阳性单克隆菌落裂解液中 PCR扩增到 IL-15基因的系列启动子,初步证实重组体构建成功。

图2 PCR鉴定电泳图Fig.2 The electrophoresis of PCR for identification

3.3 IL-15启动子报告基因载体的酶切鉴定

经 KpnⅠ和 XhoⅠ双酶切后,各重组体均得到同一大小的空载体 p GL3-Basic(4 808 bp)片段和不同大小的系列启动子片段,进一步证实 IL-15系列启动子报告基因载体构建成功 (图 3)。

图3 空载体 p GL3-Basic及双酶切电泳图Fig.3 The electrophoresis of p GL3-Basic and double digestion for identification

3.4 启动子活性的检测

报告基因荧光检测显示,p GL3-Basic空载体及p GL3-Basic-IL-15PromoterF0重组体转染 HaCaT细胞后表现出启动子活性。图 4所示为重组体 F0与空载体各自的萤火虫荧光值与海肾荧光值之比,其中空白对照组的 F0重组体/空载体荧光比值为1.35;LPS组的 F0重组体 /空载体荧光比值为5.23;p GL3-Basic-IL-15PromoterF0的 LPS组 /空白对照组荧光比值为 4.05(各数据比较:P＜0.05),说明 LPS组及空白对照组其重组体 F0转染前后的荧光值有差异,且 LPS组更明显。由此可得 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0具有启动子活性,提示所克隆及重组的 IL-15基因 5′上游 2 086 bp片段内包含核心启动子序列。

图4 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0启动子活性Fig.4 The activity of p GL3-Basic-IL-15PromoterF0

4 讨 论

IL-15在机体自然免疫中发挥着重要的调节作用[3-4]。IL-15功能多样,涉及外周血 T细胞的增殖、活化B细胞抗体的分泌、NK细胞的增殖和细胞因子的分泌[5]及抗病毒作用[6]等,其正常表达是机体自然免疫功能的重要维系,异常表达则与类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病和艾滋病等密切相关[2],因此研究 IL-15基因表达调控及其机制具有重要的现实意义。

目前对 IL-15基因表达调控机制研究还处在一个不充分的水平,人们仅发现在其基因调控序列中存在有常见的保守性序列,即 IRF[7],NF-κB[8],g-IRE,myb和 GCF等结合位点,部分与 IL-15调控有关的未知序列[9]以及由 mRNA翻译成前体蛋白过程中的几个调控点[10]。我们的研究意在寻找 IL-15基因 5′上游调控序列的核心启动子区域,试图更加充实和完善 IL-15基因表达的调控机制。

报告基因技术近年来普遍用于分析启动子活性,尤其是单管双报告酶系统,其灵敏度高、检测方便且具有内参照系统 phRL-CMV,可以实现实验报告基因测试的归一化,提高实验的准确度。因此我们根据相关启动子分析软件设计了七对逐步缺失的启动子引物,经 PCR从 HaCaT细胞基因组克隆出系列启动子构建到含萤火虫荧光素酶的报告基因载体p GL3-Basic上,然后经过 PCR和双酶切鉴定,证实成功构建 IL-15基因系列启动子报告基因载体。在此基础上,对启动子活性的初步分析中我们选择了其中一个含最长启动子序列的报告基因载体 p GL3-Basic-IL-15PromoterF0(同时另转染空载体 p GL3-Basic做阴性对照)和内参照海肾报告基因载体phRL-CMV一同经 Lipofectamin 2000转染至 HaCaT细胞,同时设置空白对照组和 LPS组处理,经荧光检测后发现两组均具有启动子活性,且 LPS组活性较空白对照组更明显。这进一步证实报告基因载体构建成功,同时也证明我们选择的 IL-15基因调控序列中包含其核心启动子序列,为下一步 IL-15基因表达调控机制的研究奠定了实验基础。

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Construction of human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors

TAO Qian-shan,LUO Xin,CHA IYu,HU Dao-jun,ZHANG Sheng-quan
(Department of Biochemistry and Molecular Biology,Anhui Medical University,Hefei 230032,China)

Purpose To clone series of the human IL-15 gene promoter and to construct seven luciferase reporter gene vectors containing IL-15 promoter regions.Methods Seven DNA fragments of the 5′flanking region of human IL-15 gene were isolated from genomic DNA of HaCaT cellsby polymerase chain reaction(PCR).After being digested with restriction enzymes,IL-15 gene family promoters were inserted into the luciferase reporter vectors PGL3-Basic.Then the recombinant construct which contains the largest IL-15 promoter region was transiently transfected into HaCaT cells.6 hours later,cells were respectively treated with DMEM,LPS.Then the activity of luciferase was detected.Results Seven-fragments of IL-15 gene promoter were amplified by PCR,and the identification of PCR and double digestion of recombined plasmid was completely correct.The experiment of transient transfection showed that the largest IL-15 promoter region has the significant activity.Conclusion The human IL-15 gene promoter luciferase reporter gene vectors have been constructed successfully.The analysis of activity in HaCaT cells indicated that the cloned IL-15 gene family promoters contain the key cis-regulatory elements.It will be essential to further study the regulation of IL-15 expression.

IL-15;Promoter;Dual luciferase reporter gene

Q782;Q785

A

1005-1678(2011)03-0187-04

2010-06-28

安徽省自然科学基金 (050430604);安徽省重点实验室优秀中青年科研带头人专项基金

陶千山,男,在读硕士研究生;张胜权,通信作者,副教授,博士,E-mail:sqz36@yahoo.com。