赵文竹，于志鹏，于一丁，何帅，刘静波

（吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室，吉林 长春 130062）

均匀设计微波法提取玉米须中β-谷甾醇

赵文竹，于志鹏，于一丁，何帅，刘静波*

（吉林大学军需科技学院营养与功能食品研究室，吉林 长春 130062）

建立微波法提取玉米须β-谷甾醇的最佳提取工艺模型。采用微波萃取提取玉米须中的β-谷甾醇物质，并通过混合因素均匀设计考察乙醇浓度，提取时间，提取功率，液固比，提取温度和提取次数6个因素对玉米须β-谷甾醇含量的影响。通过Matlab软件处理所得试验数据可知，提取时间、温度与提取β-谷甾醇的含量成反比，乙醇浓度，液固比与提取β-谷甾醇的含量成正比，提取功率、提取次数的相关系数较小可忽略。经软件分析可知提取的最佳工艺为微波提取时间5 min，乙醇浓度95%，提取温度20℃，液固比30:1（mL/g），β-谷甾醇的含量为0.24%。

紫外检测;β-谷甾醇;玉米须;微波提取；均匀设计

玉米须是传统中药，为禾本科植物玉蜀黍的花柱和柱头。《滇南本草》（玉麦须）、《现代实用中药》(玉蜀黍蕊)、《河北药材》(棒子毛)等中医药典籍中都有玉米须的记载。美国食品药品管理局[1]确认其安全、无毒，其提取物所制药品为非处方药。玉米须存在多种化学成分[2]，包括氨基酸，维生素，生物碱，单宁酸，无机盐，多糖等物质，同时也含有大量的挥发性物质[3]。β-谷甾醇为其有效成分之一，具有降低胆固醇[4]、抗炎、抗癌、抗氧化、防治高血压等生理功能[5]。β-谷甾醇衍生物由于其特有的生物学特性和理化特性被广泛的应用[6]于医药、食品、饲料等行业中。

植物甾醇是一种具有环戊烷并氢化菲结构的物质[7],主要存在于植物油不皂化物中,不同植物油中所含的植物甾醇是不一样的。据来源不同也可分为植物甾醇、动物甾醇和菌类甾醇三大类。天然植物甾醇种类繁多,主要包括谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四种[8]。植物甾醇分析可以使用高效液相色谱法[9]、气相色谱法[10]和薄层色谱法[11]。本文采用紫外分光光度[12]测定玉米须β-谷甾醇含量。通过先进的微波提取工艺，对玉米须样品中β-谷甾醇提取，进行多因素的试验优化设计，并以此得出最佳试验参数，确定微波提取玉米须β-谷甾醇的最优方法。

1 材料与方法

1.1 材料

β-谷甾醇：成都曼思特生物科技有限公司；氯仿、乙醇均为分析纯试剂：北京化工厂生产；去离子水超纯水机：美国MILLIPORE公司生产；752-PC型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司生产；AG204型电子天平：瑞士METTLE TOLEDO；BUCHI R-250旋转蒸发仪：SWIZERLAND BüCHI；旋转蒸发器、恒温水浴锅、循环水真空泵：巩义市英峪高科仪器厂；微波萃取仪MAS-II：上海新仪微波化学科技有限公司。

玉米须：由吉林大学军需科技学营养与功能食品研究室提供。

1.2 玉米须β-谷甾醇的测定

玉米须β-谷甾醇含量的测定以β-谷甾醇为标准品，氯仿溶解定容后，以氯仿为空白对照液，采用紫外分光光度法测定玉米须β-谷甾醇含量。

1.2.1 玉米须β-谷甾醇最大吸收波长的确定

以氯仿为空白对照，在200 nm～400 nm波长范围内每隔10 nm测定一次吸光值。根据测定试验数据，以波长为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘制扫描图。

1.2.2 标准曲线的绘制

精密称取18 mg β-谷甾醇标准样品，用氯仿定容到10 mL为对照液（浓度为1.8 mg/mL）。用刻度移液管分别准确量取对照液 0、0.3、0.5、1.0、1.2、1.5、2、2.5 mL于5 mL容量瓶中，加氯仿至刻度，摇匀。浓度分别是0、0.108、0.18、0.36、0.43、0.54、0.72、0.9mg/mL。在 243nm波长下测定标准品的吸光值，以吸光值为纵坐标，以浓度为横坐标绘制β-谷甾醇标准曲线。

1.3 玉米须β-谷甾醇提取方法的研究

1.3.1 玉米须β-谷甾醇提取工艺流程

玉米须→精筛→清洗→晾干→粉碎→微波提取→过滤→氯仿萃取→定容10 mL→243 nm待测

1.3.2 混合因素均匀设计提取玉米须中β-谷甾醇

精密称取玉米须2 g，采用微波提取法[9]提取玉米须中的β-谷甾醇，分别考察微波提取时间、温度、功率、乙醇的浓度、液固比及提取次数等6个因素，采用混合因素均匀设计优化法设计了6个因素不同水平的试验方案，玉米须β-谷甾醇提取液旋转蒸发，蒸干所用溶剂，用氯仿萃取后定容于10 mL容量瓶。因素水平表见表1。

表1 因素水平表Table 1 The level of the factor

1.4 玉米须中β-谷甾醇定性测定

1.4.1 化学试剂特征显色法

β-谷甾醇可以用化学试剂特征显色法进行定性分析[13]。本文采用β-谷甾醇遇浓硫酸特征显色反应验证提取液中β-谷甾醇的存在。以β-谷甾醇标准品为对照，分别取均匀设计的12个玉米须β-谷甾醇提取液各2 mL于试管中，沿试管壁缓慢滴加1 mL浓硫酸，慢慢竖起试管，观察液面交界处颜色。

1.4.2 HPLC法鉴定玉米须β-谷甾醇

1.4.2.1 对照液配制

精密称取β-谷甾醇对照品2.3 mg，置10 mL容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤即得。

1.4.2.2 提取液的制备

取上述最优提取条件下提取液100 mL，蒸干有机溶剂，加色谱级甲醇，定容至10 mL，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)过滤，即得。

1.4.2.3 色谱条件

试验采用C18反相色谱柱，流动相为色谱级甲醇（进行等度洗脱），流速为0.8 mL/min，检测波长210 nm，柱温为26℃，进样量为10 μL。

2 结果与分析

2.1 玉米须β-谷甾醇最大吸收波长的检测和标准曲线的绘制

在200 nm～400 nm紫外光区，每隔10 nm测定β-谷甾醇含量，得到扫描图如图1所示，其最大吸收波长为243 nm，在243 nm处测定标准β-谷甾醇吸光度，即可得到β-谷甾醇浓度与吸光度标准曲线，如图2所示，其回归方程为y=0.5378x-0.0017，R2=0.9934，可知标准曲线的线性关系良好。

图1 β-谷甾醇提取液扫描图Fig.1 The scanogram of β-sitosterol extraction

2.2 混合因素提取β-谷甾醇试验方案的建立

对玉米须β-谷甾醇的微波提取时间和乙醇浓度分别进行了12水平的设计，对提取温度、液固比和提取功率分别进行了6水平的试验设计，对微波提取次数进行了三水平的试验设计，得混合因素的均匀设计方案如表3所示。

用回归模型矩阵式方法，采用Matlab软件可得各因素的相关系数及F回，处理数据见表4。

图2 β-谷甾醇标准曲线Fig.2 The standard curve of β-sitosterol

表3 均匀设计试验结果Table 3 The uniformity experiment and result

表4 方差分析表Table 4 The analysis of variance

由表4数据可知，该试验的回归方程为Y=0.19406-0.00082X1+0.06432X2-0.00042X3-0.00001X4+0.00075X5+0.00001X6，通过方程系数可知，微波提取试用验中提取次数和提取功率不显著，其中提取温度和时间与微波提取的β-谷甾醇的含量成反比，乙醇浓度和液固比与β-谷甾醇的含量成正比，回归方程在0.05水平显著，通过软件处理可知回归方程Y最大值为0.26397，将最大Y值带入所得标准曲线方程y=0.5378x-0.0017中，可以计算出玉米须中β-谷甾醇含量为0.24%，提取的最佳工艺为微波提取时间为5 min，乙醇浓度为95%，提取温度为20℃，液固比为30:1(mL/g)。

2.3 β-谷甾醇定性检验

2.3.1 显色剂定性测定

文中采用在玉米须提取液中滴加浓硫酸的显色方法，对β-谷甾醇标准品和β-谷甾醇提取物进行了显色反应，以便确定玉米须提取液中β-谷甾醇的存在，经鉴定发现，在试管中液面交界处有玫瑰红色生成，且静置一段时间后下层有黄绿色液体变为红褐色。各提取液中加浓硫酸显色情况统计如表5所示。

表5 定性检测统计表Table 5 The statistical table of determine the nature

2.3.2 液相色谱定性测定

液相色谱定性测定见图4。

图4 β-谷甾醇对照品和提取液的高效液相色谱图Fig.4 The HPLC of the standard and the extraction

通过标准品的高效液相色谱图可发现，在5 min以前出现了3个溶剂峰，在6.3 min和9 min左右出现β-谷甾醇对照品的色谱峰，同样的色谱条件下检测样品提取液，在6.3 min和9 min左右也出现了2个色谱峰，由此可知，提取液中含有β-谷甾醇，其中2个物质峰可能表明β-谷甾醇存在同分异构体。

3 结果与讨论

试验采用紫外分光光度计测定β-谷甾醇标准品，可得标准曲线方程y=0.5378x-0.0017，相关系数R2＝0.9934，采用高效液相色谱法和显色剂定性测定法，可知提取液中含有β-谷甾醇。

考虑到乙醇具有毒性低，生产安全性好，价格便宜的特点，且易于工业化及回收，所以采用乙醇作为本试验的提取溶剂。采用Matlab软件分析微波法提取玉米须β-谷甾醇含量可知，β-谷甾醇的提取量随微波提取时间的增大而减小，随着提取时间的增加含量降低，随微波提取温度的增大而减小，原因可能是在微波辐射过程中，电磁波把能量直接传播到原料内部，使之瞬时加热，当提取时间过长时产生过高温度，使β-谷甾醇活性成分湿热降解或异构化，导致提取物有效成分含量降低。在微波加热过程中随着温度的升高，β-谷甾醇的活性成分被破坏，导致提取率的降低。但Matlab软件处理试验数据时只能逼近显著性因素的最优区域，微波法提取玉米须β-谷甾醇的最优工艺仍需在此基础上进行多元线性回归设计，以求得最优提取工艺参数。

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Extracting the β-Sitosterol from Maydis Stigma by Mix-Factor Uniformity Design

ZHAO Wen-zhu,YU Zhi-peng,YU Yi-ding,HE Shuai,LIU Jing-bo*
（Laboratory of Nutrition and Functional Food,College of Quartermaster Technology,Jilin University,Changchun 130062,Jilin,China）

To establish the method of β-sitosterol extracted by microwave.The β-sitosterol of the Stigma Maydis was extracted by mix-factor uniformity design,and the relationships of the alcohol concentration,extract time,extract power,the rat of dosage liquor,extract temperature and extract frequency with the β-sitosterol content were analyzed.The coefficient correlation of the exact power and exact progression may ignore due to little.The best extract technology is the 5 min,95%of the alcohol concentration,the ratio of solid to liquid was 30:1（mL/g）,and the extracting ratio of β-sitosterol was 0.24%.

uv detection;β-sitosterol;stigma maydis;microwave extraction;uniformity design

吉林省科技厅农业重点项目（20080224）

赵文竹（1986—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：营养与功能食品。

*通信作者：刘静波（1962—），女(汉)，教授，博士，研究方向：营养与功能食品。

2009-10-13