王廷安,沈海英,申云侠,王文波,王本敬,梁幼生,诸葛洪祥

2.江苏省血吸虫病防治研究所,无锡 214064

该法能检测出1条尾蚴提取的DNA分子〔3〕。受此启发,将之推广用于鉴别水体中日本血吸虫毛蚴的试验,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物和钉螺 昆明小鼠,由苏州大学实验动物中心提供,体重为23±2g。阳性钉螺购自江苏省血吸虫病防治研究所。

1.2 主要仪器和试剂 梯度PCR仪(Mastercycler gradient 5331,Eppendorf,德国产),凝胶成像系统(Genegenius,SYNGENE,英国产),超速冷冻离心机(AllegraTM21 R centrifuge,BECKMAN COULTER,美国产),生物分光光度计(Biophotometer,Eppendorf,德国产),转移电泳仪(DYY-Ⅲ6,北京六一仪器厂产)。蛋白酶K(购自 TAKARA,批号为CB23O2A),DNA标志物(100bp的 DNA marker ladder,购自TIANGEN公司,批号为G5410),Taq DNA酶(购自宝生物工程(大连)有限公司,批号为CK 4501CA)。

1.3 动物感染 固定小鼠,腹部剃毛用去氯水湿润后将计数好的载有尾蚴的盖玻片贴于暴露的小鼠皮肤上,每只小鼠感染 40±5条,20min后去除盖玻片〔4〕。

1.4 毛蚴的孵化和富集 感染6～8 w后解剖小鼠,取约20g肝脏研磨,用1.2%生理盐水沉淀肝脏组织以获取血吸虫卵,按罗金萍的改良血吸虫毛蚴孵化法〔5〕进行孵化,并利用间接连续离心法富集毛蚴,备用。

1.5 模板DNA的制备 取上述富集毛蚴的EP管,加入200μL细胞裂解液,混匀,置于 37。C水浴锅中过夜,采用蛋白酶K-苯酚法并参照〔6〕提取毛蚴基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定,备用。

1.6 引物设计 根据GenBank中的日本血吸虫18S-rDNA基因序列(DQ442999),应用Primer Premier 5.0软件和Oligo 6软件,设计1对特异性引物,扩增片段长度为463 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成:

引物 1:5′-ATTCCGATAACGAACGAGAC-3′

引物 2:5′-AAGCCACTACAACGACACCA-3′

1.7 PCR扩增及产物鉴定 PCR反应体系(25μL):模板DNA 2.0μL,dNTPs 1.0μL,10×PCR 缓冲液 2.5μL, 上、下游引物各1.0μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,灭菌双蒸水17.0μL。94。C变性 5min,94。C变性 20s,56。C退火 30s,72。C延伸40s,共 30个循环,最后 72。C延伸 5min,结束后4。C等待。取各PCR扩增产物10μL,2μL 6×上样缓冲液混合,6μL DNA marker ladder标志物,1.5%的琼脂糖凝胶电泳30min后转移到含有溴化乙锭(EB)的搪瓷盘里浸染25min,在凝胶图像分析系统下观察结果并拍摄图像。根据DNA标志物,样品的PCR扩增产物在463 bp位置处出现红橙荧光带即为阳性,否则为阴性。得到扩增产物的日本血吸虫毛蚴DNA,作为以后梯度稀释进行PCR扩增的阳性对照模板DNA。

1.8 梯度稀释检测PCR的灵敏性试验 用eppendorf Biophotometer测定日本血吸虫毛蚴的DNA浓度,用TE缓冲溶液先稀释5倍再以2倍倍比稀释日本血吸虫毛蚴DNA溶液,依次为 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280及1∶2 560,按选定的PCR反应条件进行扩增,并用琼脂糖凝胶电泳检测PCR的灵敏性和特异性。

2 结 果

2.1 蛋白酶K-苯酚法抽提毛蚴基因组DNA 经过间接连续离心法富集的毛蚴,加入细胞裂解液37。C过夜处理后,再加入等体积的平衡酚,分层明显且产生大量乳白色物质见图1。抽提的毛蚴DNA经琼脂糖凝胶电泳后有清晰条带,见图2效果良好。

图1 蛋白酶K-苯酚法抽提毛蚴DNAFig.1 The miracidium DNA was extracted by Proteinase K-phend method

2.2 PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳 日本血吸虫毛蚴DNA经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳后,得到一条约463bp的条带,与靶DNA片段位置相同,而阴性对照组则无扩增产物见图3。

2.3 梯度稀释检测PCR的灵敏性试验 取日本血吸虫毛蚴DNA溶液5μL,稀释20倍后用eppendorf BioPhotometer测定日本血吸虫毛蚴的DNA浓度为 4μg/mL,其中 A 260/A 280为 1.33,A 260/A 230为1.53。通过梯度稀释后发现,PCR方法可检测出特异性条带的最大稀释比为1∶1 280,即可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最小浓度为62.5 pg/μL,稀释比1∶2 560组和阴性对照组均无扩增产物见图4。

图4 梯度稀释检测PCR的灵敏性试验M:DNA Marker(100bp),1:阳性对照,2～11:日本血吸虫毛蚴(稀释度分别为1∶5,1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640,1∶1 280及 1∶2 560),12:阴性对照。Fig.4 The specificity and massdetection experiments of PCR assay

3 讨 论

准确灵敏地检测水中是否含有日本血吸虫毛蚴与尾蚴,对可能接触疫水的人群和牲畜及时预警,并对疫区水体和周边环境及时处理,控制血吸虫病流行,巩固血吸虫防治的效果具有重要意义。虽然对尾蚴的监测是通过滩涂投放哨鼠,可以监测血吸虫尾蚴分布。但是,这种检测方法周期性长、影响因素多,成本大。近年研究资料表明,检测血吸虫DNA的PCR 技术已经建立。Hanelt等〔7〕根据曼氏血吸虫18S rDNA基因设计了两对引物,建立了巢式PCR(nest-PCR),其实验过程比较繁琐。陈一平等〔8〕通过巢式PCR能够检测到单个虫卵、单个尾蚴或者针尖大小的成虫组织,且与人类基因组和肠道细菌无交叉阳性出现。陈军虎等〔9〕根据日本血吸虫18S r RNA基因设计了一对引物,建立了检测日本血吸虫感染性钉螺的PCR方法。周立等〔10〕运用实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫DNA,最低检测浓度约为6pg。秦圆方等〔11〕建立的检测日本血吸虫感染的SYBR Green荧光定量PCR法可在每200mg粪样仅含1个虫卵时,荧光定量PCR结果呈阳性。但对检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法,目前国内外尚未见专门的研究报道。在漫长的生物进化过程中,真核生物的18S rDNA基因为保守序列,进化速率慢,这些序列在不同个体中碱基差异不大,保守性好,用这些多拷贝基因序列进行检测,可以增强扩增灵敏度。

本研究利用引物设计软件Primer Premier 5.0和Oligo 6自主设计了特异性引物,采用间接连续离心法富集毛蚴,蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因组DNA,并以日本血吸虫保守序列18S rDNA基因作为靶片段,选择了合适的PCR反应体系和条件,建立了检测日本血吸虫毛蚴的PCR方法。本研究表明,PCR扩增日本血吸虫毛蚴DNA,得到了与靶片段位置相同的特异性条带,特异性很强;梯度稀释检测PCR的灵敏性试验显示,PCR方法可检测出特异性条带的最大稀释比为1∶1 280,即可检测出日本血吸虫毛蚴DNA的最小浓度为62.5 pg/μL,灵敏性极好,具有很大的潜力推广应用于现场检测水体中日本血吸虫毛蚴,可起到一定的预警作用。

〔1〕Utzinger J,Zhou XN,Chen MG,et al.Conquering schistosomiasis in China:the long march〔J〕.Acta Trop,2005,96(2-3):69-96.

〔2〕郑江.中国血吸虫病防治现状及展望〔J〕.中国血吸虫病防治杂志,2003,15(1):1-2.

〔3〕Driscoll AJ,Kyle JL,Remais J.Development of anovel PCR assay capable of detecting a single Schistosoma japonicum cercaria recovered from Oncomelania hupensis〔J〕.Parasitology,2005,131:497-500.

〔4〕杜海林,诸葛洪祥,魏莉,等.青蒿琥酯对日本血吸虫生殖作用的影响〔J〕.中国人兽共患病学报,2009,25(5):453-455,476.

〔5〕罗金萍.血吸虫毛蚴孵化法的改进〔J〕.咸宁学院学报(医学版),2005,19(6):464.

〔6〕吴士良,王武康,王尉平.〔M〕.苏州:苏州大学出版社,2001:96-97.

〔7〕Hanelt B,Adema CM,Mansour MH,et al.Detection of Schistosoma mansoni in Biomphalaria using nested PCR〔J〕 .J Parasitol,1997,83:387-394.

〔8〕陈一平,翁心华,徐肇玥,等.聚合酶链反应检测日本血吸虫5D基因的实验研究〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,1998,16(1):58-61.

〔9〕陈军虎,闻礼永,张旭照,等.检测日本血吸虫感染性钉螺PCR方法的建立〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2006,24(3):204-207.

〔10〕周立,梁冰,赵友云,等.实时荧光定量PCR法检测日本血吸虫〔J〕.中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2008,26(4):299-303.

〔11〕秦圆方,刘云,杜学利,等.SYBR Green荧光定量粪检PCR法检测日本血吸虫感染的敏感性研究〔J〕.中国病原生物学杂志,2009,4(6):432-435.