谢 莉,程 华,董 超,李志平,朱俊平,闫静辉,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家庄 050081; 2.河北省兽药监察所,河北石家庄 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家庄 050071)

牛奶中抗生素残留检测试剂盒的研制及应用

谢 莉1,程 华1,董 超1,李志平2,朱俊平3,闫静辉1,＊

(1.河北省生物研究所,河北石家庄 050081; 2.河北省兽药监察所,河北石家庄 050051; 3.河北三元食品有限公司,河北石家庄 050071)

对嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢的生成、营养基质、各成分添加比例等条件进行了研究,研制出检测牛奶中抗生素残留的 96孔板试剂盒。此试剂盒对牛奶中青霉素 G的检测极限为 3ng/mL,阿莫西林的检测极限为 4ng/mL,头孢匹林的检测极限为8ng/mL。同一批奶样检测结果证明,此试剂盒与西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司同类试剂盒产品质量相当,灵敏度高于国标 TTC法,适于推广应用。

抗生素残留,检测,牛奶,嗜热脂肪芽孢杆菌

1 材料与方法

1.1 材料与设备

120份新鲜原奶样品 采自石家庄某乳制品厂;无抗奶 光明乳业股份有限公司;嗜热脂肪芽孢杆菌 河北省生物研究所保藏;青霉素 G、阿莫西林、头孢匹林、磺胺嘧啶、头孢氨苄、四环素、土霉素、溴甲酚紫 购于 SIG MA公司;ECL IPSE 50试剂盒 西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司产品;种子培养液 胰蛋白胨 1%、酵母粉 0.5%、氯化钠 0.5%,pH7.2;芽孢生成培养基 胰蛋白胨 0.3%、酵母粉 0.4%、氯化镁0.2%、氯化钙 0.1%、硫酸锰 10mg/L、琼脂 1.5%, pH7.2;营养培养基 胰蛋白胨 1%、牛肉膏 0.5%、葡萄糖 1%、琼脂 0.8%,pH7.2。

S W-CJ-2F净化台 苏州净化设备有限公司; DNP-9052恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司

1.2 实验方法

1.2.1 芽孢的生成 从斜面上挑取一环实验菌接种到盛有 50mL种子培养液的三角瓶中,于 55℃, 120r/min摇床培养,达到对数生长期后吸取 1mL菌液到已铺好的芽孢生成培养基平板中,玻璃棒涂匀,将其置于 60℃培养箱中培养,定期涂片显微镜检查芽孢生成情况[5-6]。

1.2.2 芽孢的富集 用灭菌的生理盐水洗下平板上的芽孢,5000r/min离心 10min,倾去上清液,添加生理盐水洗涤两次,最后混匀制成芽孢悬液,煮沸20min,杀死营养体,4℃保存备用。

1.2.3 抗生素检测试剂盒的制备方法 往融化的营养培养基中,加入溴甲酚紫指示剂和嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢悬液,充分摇匀后用排枪吸取混合液加到96孔板中,待其冷却后用不干胶封口。4℃保存备用。

1.2.4 制备条件的优化

1.2.4.1 营养培养基 pH及琼脂浓度的确定 调节营养培养基 pH为 6.5、6.8、6.9、7.0、7.2、7.4等不同值,进行检测实验,待确定合适的 pH后,改变琼脂浓度为 0.5%、0.8%、1.0%、1.2%,检测实验选择最佳培养基配方。

1.2.4.2 指示剂浓度的确定 用无水乙醇配制溴甲酚紫溶液浓度为 15mg/mL,再分别吸取 10、20、40、60、80μL添加到 100mL营养培养基中,进行检测实验,确定指示剂的最佳加入量。

1.2.4.3 芽孢浓度的确定 添加不同比例的芽孢悬液到营养培养基中,进行检测实验,以确定体系中需要加入的芽孢量。

1.2.5 试剂盒均一度检测 取出抗生素检测试剂盒,其中 48孔加入 50μL无抗奶作为阴性对照,48孔加入 50μL含 10mg/mL青霉素的牛奶作为阳性对照,微孔密封好后置于 65℃培养箱培养一定时间后,从微孔侧面观察,根据颜色变化进行结果判断。

1.2.6 检测结果的判断依据 黄色到黄绿色为阴性结果范围;蓝紫色为阳性结果范围;当检测结果颜色界于阴性、阳性之间时,如淡蓝色为可疑结果,是本试剂盒的检测极限。

1.2.7 不同抗生素的检测灵敏度分析 选用不同的抗生素,用无抗奶配制成不同浓度,取 50μL用试剂盒进行检测。实验结果与规定的最大残留限制(MRL)进行比对(浓度配制根据不同抗生素的MRL规定,在范围上下采用 1ng或 10ng级别递增或递减)。

我幼年开始每天早起，多年下来养成了早晨5点半左右起床的习惯，也就每天早晨“多出了”两个小时读书写作、思考工作。晚上睡前也会尽可能挤出时间阅读。长期以往养成了习惯，不读书就会若有所失，甚至会有“罪恶感”。如果一段时间读书少了，我就会尽可能安排相对多一些的时间集中阅读，求得平衡。

1.2.8 稳定性分析 制备好的试剂盒密封好后置于4℃保存 0、30、60、90、180d后,分别记录其阴性检测时间。

1.2.9 试剂盒的评价 从石家庄某乳制品厂采集新鲜原奶样品 120份,采用实验研制的试剂盒进行检测,并与西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生产的ECL IPSE 50试剂盒及国标 TTC法进行比较。

2 结果与分析

2.1 芽孢悬浮液的制备

嗜热脂肪芽孢杆菌在种子培养液中培养 14～16h后达到对数生长期,将种子液涂布到芽孢生成培养基平板中,60℃培养 6h后,开始出现芽孢,培养 24h后显微镜观察芽孢生成率达到 90%以上。用生理盐水洗下芽孢,煮沸杀死营养体,通过稀释平板计数法,调整悬液的体积,使芽孢数量达到109个 /mL。

图1 嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢

2.2 营养培养基 pH及琼脂浓度的确定

溴甲酚紫指示剂的变色范围是 pH5.2～6.8,考虑在营养培养基的 pH接近指示剂的检测极限时,芽孢萌发产酸可使指示剂颜色更好地发生变化,但实验结果发现,pH变化对反应变色时间没有明显的影响。在营养琼脂培养基灭菌前 pH为 6.5、6.8和 6.9时,制备成孔板后,微孔颜色为紫红色;pH为 7.0、7.2和 7.4时微孔中培养基呈现蓝紫色,考虑到灭菌过程中 pH的降低,以及嗜热脂肪芽孢杆菌生长所需的pH,故选择营养培养基 pH为 7.2。

实验中还发现,营养培养基中琼脂浓度越低,微孔检测反应时间越短,但琼脂浓度过低,基质过于柔软,不利于保存与运输,故选择营养培养基琼脂浓度为0.8%。

2.3 指示剂浓度的确定

实验结果表明,指示剂的添加量为每 100mL培养基添加 10、20μL时,检测微孔内的琼脂培养基颜色过浅,不利于判断;而添加量过多时则可能会对嗜热脂肪芽孢杆菌的生长造成影响,因此,最后确定每100mL培养基中加入指示剂 40μL,这时微孔显色效果较好,均呈现蓝紫色。

2.4 芽孢浓度的确定

实验结果表明,嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢浓度过低,培养后产酸太少不能使指示剂发生颜色变化,而加入量过高后,容易产生假阴性结果。经多次实验,确定芽孢悬液加入量为1%。

2.5 试剂盒均一度检测

经 65℃培养 2.5h后,加入无抗奶的 48孔均变为纯正的黄色,而加入有抗奶的 48孔仍为蓝紫色。所有微孔颜色均匀,无漏孔现象。

2.6 常用药物检测限

使用该试剂盒对牛奶中常见的 6种抗生素残留进行检测,依据颜色变化进行判断,结果见表 1。由表 1中可以看出,嗜热脂肪芽孢杆菌 96孔板法能检测出牛奶中多种抗生素,并且低于规定的最大残留检测限[7-8]。

表 1 96孔板法检测 6种药物残留的结果

2.7 稳定性分析

由于芽孢有一个衰减的过程,故芽孢数量会有一定的减少,阴性检测时间会随着时间的延长有所变化。表 2为试剂盒存放不同时间阴性检测结果。从中可以看出,阴性检测时间变化较小,试剂盒在4℃保存 6个月后,检测时间只延长了 10min,说明本试剂盒能够保证实验的稳定性。同时为了确保实验的准确性,每次实验需作阴性对照,以此来确定加热培养所需的最佳时间。

表2 试剂盒稳定性测试

2.8 试剂盒的应用

从表 3可以看出,检测同一批样品 (n=120),用本试剂盒与西班牙 ZEU- INMUNOTEC公司生产的ECL IPSE 50试剂盒的检测结果完全相同,两者阳性检出率都为 3.33%,高出国标 TTC法阳性检出率1.67个百分点,说明本试剂盒灵敏度达到国外同类试剂盒检测水平,效果好于常用的 TTC法。

表3 试剂盒的应用结果

3 结论

本实验以嗜热脂肪芽孢杆菌为指示菌,溴甲酚紫为指示剂,辅以合适的营养基质,研制了检测抗生素残留的试剂盒。为了提高检测方法的灵敏度和稳定性,在芽孢和指示剂的含量、营养基质的配方等方面进行了大量的实验。研制的试剂盒对牛奶中常见的β-内酰氨类、磺胺类、四环素类等抗生素药物具有较好的检测灵敏度,在 6个月的保存期内,具有较好的检测稳定性。采用该试剂盒与西班牙 ZEUINMUNOTEC公司生产的 ECL IPSE 50试剂盒检测同一批样品、两者检测结果完全相同,说明该试剂盒与国外同类试剂盒质量相当,但我们研制的试剂盒有很大的价格优势,利于大规模推广应用。同时与 TTC法相比,该试剂盒操作简便灵活,使用的 96微孔板可以独立分拆,奶样不用预处理,只需要一步操作即可完成,且结果直观易懂,省去了 TTC法复杂的前处理工作。因此本试剂盒可以应用于牛奶中抗生素残留的检测,适合于牧场、乳品厂及食品卫生检测部门的使用。

[1]邓斌,邓春来,张曦 .牛奶中抗生素残留及其检测方法研究进展[J].饲料工业,2003,24(4)：24-27.

[2]陈怀宇,黄周英,林育腾 .牛乳中抗生素的残留与危害现状[J].泉州师范学院学报,2004,22(6)：102-106.

[3]NEAL C E,CALBERT H E.The Application of the 2,3,5-TriphenylterfrAzolium Chloride Test for Inhibitory Substances in Milk[J].Dairy Science,1955,38：597.

[4]纪淑娟,浩淼,李东华 .TTC法检测牛乳中抗生素快速检测试纸的制作[J].食品工业科技,2009,9(2)：85322-327.

[5]P J THOMPSON,O A THAMES.Sporulation ofBacillus stearother m ophilus[J].Applied Microbiology,1967,15(5)：975-979.

[6]王天云,陈振风,王福源 .一种促使乳酸芽孢杆菌大量生成芽孢的方法[J].工业微生物,2001,31(3)：13-18.

[7]JACQUES N,HARRY V,IISE S,et al.A microbiological assay system for assess ment of raw milk exceeding EU maximum residue levels[J].IntDairy J,1999,9(2)：85-90.

[8]CODEX A.Residues of veterinary drugs in foods[S].Food and Agiculture Organization of the United Nations,FAO,Rome. 1993,3,Second Edition.

Preparation and application of kit for detection of antibiotic residue in milk

XIE L i1,CHENG Hua1,DONG Chao1,L I Zhi-ping2,ZHU Jun-ping3,YAN Jing-hui1,＊
(1.Hebei Institute ofBiology,Shijiazhuang 050081,China; 2.Hebei Institute ofVeterinaryMedision Superusion,Shijiazhuang 050051,China; 3.Hebei Sanyuan Food Co.,Ltd.,Shijiazhuang 050071,China)

In orde r to ques t for a kind of s imp le m e thod to check whe the rm ilk conta ins antib iotics in a concentra tion exceed ing the M ax im um Res idue L im its(MLR),thecond ition of thede tec tion such assp orula tion Bac illus S tea rothe rm op hillus and nutrient and add ing p rop ortion of each comp onent we re s tud ied.The es tab lished kit tha t each we ll of96p la te conta ined g row th m ed ium sp read w ith Bac illus s tea rothe rm op hilus sp ores,which assure to96 ind ividua l tes ts we re checked a t the sam e t im e.The de tec tion l im its of the kit to p enic illin,am oxic illin,cep hap irin we re3,4and8ng/mL,resp ec tive ly.Through de tec ting the sam e sp ec im en g roup(n=120),it was p roved tha t the es tab lished kit had no d iffe rence to the kit of ZEU- INMUNO TEC comp any in sens itivity and its sup e rior to TTC m e thod on sens itivity and convenience.As a result,it could be used to de tec t antib iotics in m ilk.

antib iotic res idue;de tec tion;m ilk;Bac illus S tea rothe rm op hillus

TS207.3

A

1002-0306(2010)02-0321-03

牛奶是老少皆宜的营养品,但是在奶牛的养殖过程中,为了治疗和预防奶牛乳腺炎和其它细菌感染性疾病,一些养殖户使用了青霉素等抗生素,进而在牛乳中产生了抗生素残留;更有一些不法奶农为防止细菌的大量繁殖和牛奶的酸败人为添加抗生素,原料奶中抗生素残留会影响奶制品品质,长期食用会危害人体健康。因此,牛奶中抗生素残留问题日益受到国际社会的重视,各国(均制定了相应的标准,建立了多种检测手段)也在通过各种检测技术查处有抗奶,来保障人们饮用牛奶的卫生和安全[1-2]。国外已有相关的抗生素检测试剂盒上市,但价格昂贵。而国内的商品化试剂盒较少,目前我国常采用的检测方法为 TTC法,此方法结果可靠,检测费用较低,一般实验室都能操作。但因其检测周期长、操作繁琐、结果辨别不准确等缺点,影响了在实际中的应用[3-4]。因此研制简单有效、价格低廉的检测试剂盒有广阔的市场前景。本实验室研究制作了嗜热脂肪芽孢杆菌 96孔板试剂盒,可简便、准确地检测牛奶中的抗生素残留。其原理是嗜热脂肪芽孢杆菌对多种抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素具有高度敏感性,如果被检样品中含有抗生素残留,这些物质扩散到基质中,抑制了芽孢的萌发和继续繁殖,阻断糖类转化形成有机酸,通过加入指示剂的颜色变化可进行辨别。实验对于营养培养基成分、指示剂及芽孢添加量等条件进行了探索,使检测结果达到国家标准规定的灵敏度。

2009-08-24 ＊通讯联系人

谢莉(1976-),女,工程师,主要从事食品安全方面的研究。